Экспериментальные модели для изучения нейропротекции кислотного посткондиционирования против церебральной ишемии

Общей целью лечения ацидоза на модели полосатого среза кортико в модели окклюзии средней мозговой артерии является изучение нейропротекторного эффекта кислотного посткондиционирования против ишемии головного мозга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как посткондиционирование после ацидоза может защитить ишемическое повреждение головного мозга, а также разработать новую стратегию терапии инсульта. Основным преимуществом этого метода является возможность использования широко доступных экспериментальных моделей для изучения нейропротекции посткондиционирования после ацидоза.

Демонстрировать процедуру будет Яронг Чжэн, аспирант из моей лаборатории. Начните с извлечения мозга из черепа обезглавленной мыши с помощью тонкого шпателя и осторожно опустите его в стакан, содержащий ледяной обычный ACSF, уравновешенный пятью процентами углекислого газа и 95 процентами кислорода. Нанесите криопреципитатный клей на вибратоновую пластину в две полосы.

Положите кусочек трехпроцентной агарозы на самую дальнюю от лезвия полоску клея, чтобы поддержать мозг. Затем с помощью щипцов перенесите мозг на фильтрующую бумагу. Отрежьте лезвием лобную стойку и мозжечок.

Поместите мозговую ткань вертикально на свободную полоску клея так, чтобы мозг был прислонен к агарозе. Добавьте ледяной ACSF в режущий резервуар, чтобы погрузить мозг, и добавьте лед в область держателя льда. Держите ACSF в резервуаре с пятью процентами углекислого газа и 95 процентами кислорода.

После настройки вибратона на резку секций 400 микрон и правильного расположения мозга относительно режущего лезвия, нажмите кнопку старт-стоп, чтобы начать автоматическую резку. С помощью пастеровской пипетки с отрезанным наконечником перенесите пять срезов мозга один за другим и поместите их в держатель для салфеток в ледяном обычном ACSF, пузырчатом с пятью процентами углекислого газа и 95 процентами кислорода. Через 30 минут при комнатной температуре поместите срезы мозга на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на десять минут, чтобы восстановить синаптическую функцию.

Поместите ACSF без глюкозы и кислотный ACSF в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и взбейте растворы с пятью процентами углекислого газа и 95% азота и 20 процентами углекислого газа и 80% кислорода соответственно в течение 30 минут. Осторожно перенесите четыре из пяти срезов мозга в предварительно нагретую до 37 градусов Цельсия жидкость без глюкозы и инкубируйте в течение 15 минут. Чтобы изучить временное окно для кислотного предварительного кондиционирования, перенесите один срез непосредственно из безглюкозного ACSF в кислый ACSF, а остальные три среза перенесите в обычный ACSF для реперфузии.

Через три минуты переложите ломтик в кислый ACSF в обычный ACSF. Затем через пять минут в обычном ACSF перенесите один из срезов из обычного ACSF в держатель ткани в кислом ACSF на три минуты. Таким же образом перенесите еще один ломтик через 15 минут после реперфузии.

Оставшийся срез, который был помещен в свободный от глюкозы ACSF, но не кислый ACSF, устанавливается как группа кислородной глюкозной депривации. Переложите срезы из ACSF в лунки 24-луночной пластины, содержащей раствор TTC. Растяните дольку в растворе.

А затем выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия на неглубокой водяной бане в течение 30 минут. Далее переложите ломтики в чистые, взвешенные, 1,5 миллилитровые центрифужные пробирки, застеленные фольгой, и измерьте сухой вес ломтиков. После взвешивания извлеките Формазан, добавив в пробирки раствор этанола и диметилсульфоксида один к одному в соотношении объемного и массового значения 10 к одному.

Инкубировать вдали от света в течение 24 часов. На следующий день перенесите раствор диметилсульфоксида этанола из трубок на 96-луночный планшет и измерьте поглощение на 490 нанометрах с помощью планшетного ридера. Сначала подтвердите правильную анестезию отсутствием рефлекса защемления пальца ноги.

Затем поместите мышь под наркозом с помощью зонда LDF, прикрепленного к ее черепу в лежачем положении на спине, и зафиксируйте с помощью стерильных хлопчатобумажных нитей. Продезинфицируйте выбритую кожу шеи 75%-ным этиловым спиртом. Затем, сделав околосрединный разрез кожи на шее, тупыми рассекают мягкие ткани щипцами, чтобы обнажить кровеносные сосуды.

Добавьте одну каплю физиологического раствора в открытые ткани, чтобы сохранить их увлажненными. Затем с помощью офтальмологических щипцов рассеките общую сонную артерию от окружающих тканей и блуждающего нерва. Будьте осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв.

Поместите зажим микрососуда на дистальный конец общей сонной артерии. И завяжите мертвый узел шелковыми швами 6-0 на проксимальном конце. Затем завяжите свободный узел проксимальнее зажима в качестве временного шва.

Затем с помощью микроофтальмологических ножниц сделайте небольшой продольный разрез между двумя узлами как можно ближе к мертвому узлу. Теперь введите 12 миллиметров, наконечником затупленную мононить через разрез в просвет артерии и продвинуте ее на несколько миллиметров. Затяните свободный узел вокруг кончика мононити, а затем снимите зажим.

Затем используйте офтальмологические щипцы для продвижения нити во внутреннюю сонную артерию до тех пор, пока программное обеспечение LDF не покажет резкое снижение кровотока. Запишите время начала окклюзии. Затем отрежьте зонд LDF и поместите мышь в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия на один час окклюзии.

Через 55 минут после начала окклюзии обезболить животное изофлураном и расположить животное в прежнем положении. Затем откройте разрез на шее и снова обнажите общую сонную артерию. После периода окклюзии с помощью офтальмологических щипцов аккуратно вытяните нить для достижения реперфузии.

Затем превратите временный шов в постоянный, затянув узел. Для лечения ацидоза введите газ, вдыхаемый носовым обтекателем, на 20% углекислого газа, 20% кислорода и 60% азота на пять минут. После закрытия разреза прерванным хирургическим швом поместите мышь в клетку с температурой 30 градусов Цельсия до тех пор, пока мышь не придет в сознание.

На этой гистограмме показаны результаты анализа TTC, проведенного на срезах коры головного мозга после кислородного голодания глюкозы и кислотного посткондиционирования, как показано в этом видео. Трехминутное лечение ацидоза было нейропротекторным, если лечение было начато немедленно или через пять минут после кислородного голодания глюкозы, но не было случаев, когда срезы были реперфузированы в течение 15 минут. Мышей подвергали окклюзии средней мозговой артерии в течение 60 минут и лечили путем вдыхания 20% углекислого газа в течение пяти минут через пять, 50 или 100 минут после реперфузии.

Объем инфаркта количественно определяли путем окрашивания двумя, тремя, пятью трифенилтетразолия гидрохлоридом через 24 часа после реперфузии, на что указывают черными пунктирными линиями. На этой гистограмме показан процент объема инфаркта для каждого состояния. Нейропротекция от кислотного посткондиционирования была устойчивой даже при задержке начала до 50 минут после реперфузии.

Тем не менее, лечение ацидоза, начатое через 100 минут, не блокировало ишемическое повреждение. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать нейропротекцию посткондиционирования ацидоза на модели OGD срезов мозга и на модели MSO мышей. При проведении процедур важно помнить, что продолжительность и продолжительность ацидоза очень важны для воспроизведения защитного эффекта.