Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

Общая цель данного анализа RNASeq в образцах личинок данио-рерио состоит в том, чтобы определить профили экспрессии генов эмбрионов и личинок рыбок данио-рерио и сделать количественные сравнительные заявления об изменениях экспрессии генов между образцами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в любой области, в которой эмбрионы или личинки данио-рерио информативны, например, как подавление одного целевого гена приводит к изменениям экспрессии генов или нарушению определенных путей по сравнению с другими условиями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что рыбки данио поддаются производству большого количества животных, и можно легко получить данные транскриптома целых животных.

Кроме того, выделение конкретных типов клеток может быть легко достигнуто с помощью сортировки трансгенных животных. Демонстрировать процедуры будут Лэйн Хостелли, аспирант, и Джессика Несмит, постдок из моей лаборатории. Для начала культивируют эмбрионы до трехмесячного возраста, который является репродуктивной зрелостью.

Отделите двух взрослых самцов и трех самок рыб от нужного штамма в отдельные брачные резервуары с пресной водой системы вечером накануне сбора эмбрионов. На следующее утро, после того как зажгется свет, снимите разделитель и позвольте рыбам спариваться естественным образом, пока на дне аквариума не будут замечены эмбрионы. Соберите эмбрионы с 30-минутными интервалами в отдельные чашки Петри среды для эмбрионов до тех пор, пока не будет собрано нужное количество.

Чтобы определить стадию эмбрионов, культивируйте их в группах от 50 до 75 на 10-сантиметровую чашку Петри, чтобы обеспечить последовательное время развития всех эмбрионов. Затем держите тарелки при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Измерьте возраст эмбриона с помощью сомитного числа после сегментации примерно через 24 часа после оплодотворения, или HPF, и разделите эмбрионы в зависимости от возраста развития.

После усыпления эмбрионов на нужной стадии согласно текстовому протоколу, переложите пул из 20 эмбрионов в пробирку микроцентрифуги с маркировкой объемом 1,5 миллилитров. Затем удалите излишки эмбриональной среды из микроцентрифужной пробирки. Добавьте в пробирку 200 микролитров реагента для лизиса.

И используйте пестик для механической гомогенизации эмбрионов. Затем добавьте дополнительно 800 микролитров реагента для лизиса, чтобы довести общий объем до одного миллилитра. Чтобы извлечь РНК, добавьте к собранному образцу реагент для лизиса и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 5 минут.

Добавьте 0,2 миллилитра хлороформа на каждый 1 миллилитр используемого реагента для лизиса, и переверните пробирки вручную в течение 15 секунд. После инкубации образцов при комнатной температуре в течение двух-трех минут центрифугируйте образцы при температуре 12 000 G и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Отделенную водную фазу переложите в свежую пробирку и добавьте 0,5 миллилитра изопропанола на каждый 1 миллилитр используемого реагента для лизиса.

После инкубации пробирок при комнатной температуре в течение 10 минут центрифугируйте образцы в течение 10 минут. Затем добавьте 75% этанола в РНК и центрифугируйте пробирки при температуре 7,500 G и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Полностью удалите надосадочную жидкость и дайте образцу высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Затем повторно суспендируйте РНК в 15-30 микролитрах воды, обработанной DEPC. Чтобы очистить высококачественную РНК после извлечения гранулы и промывки образца в соответствии с текстовым протоколом, используйте абсорбционный спектрофотометр для анализа извлеченной РНК на концентрацию и чистоту. Убедитесь, что значение 260 на 230 составляет около 2,0, прежде чем отправлять образцы РНК поставщику или корпусу для анализа RNASeq и изменения экспрессии генов на основе количественной оценки прочтений секвенирования.

Чтобы сравнить одно экспериментальное состояние с контрольной группой, откройте данные дифференциально экспрессируемых генов в программном обеспечении для управления электронными таблицами. Нажмите стрелку раскрывающегося списка рядом с кнопкой сортировки и выберите пользовательскую сортировку в таблице. В появившемся окне выберите поле под столбцом и выберите сортировку по столбцу LFC.

В столбце сортировки по убедитесь, что выбраны значения. В столбце «Порядок» выберите сортировку от большего к меньшему и нажмите кнопку «ОК». Чтобы определить дифференциально экспрессируемые гены, обнаруженные в двух экспериментальных условиях, в таблице «экспериментальный» и «контрольный» выберите первую ячейку в пустом столбце.

Затем введите в ячейку следующее уравнение. Нажмите клавишу Enter или Return, чтобы запустить уравнение. Выделите ячейку, содержащую уравнение, и нажмите на поле в правом нижнем углу ячейки.

Удерживайте кнопку мыши и перетащите выбранную область вниз по столбцу, пока не выберите последний идентификатор функции, чтобы скопировать уравнение в каждую ячейку столбца. Выберите пользовательскую сортировку еще раз и добавьте второй уровень сортировки, нажав значок плюса в левом нижнем углу. На первом уровне отсортируйте по, в столбце выберите дубликат.

В разделе Сортировка по выберите значения, а в разделе Порядок выберите Z, чтобы A.In на второй уровень, затем в столбце выберите LFC. В разделе Сортировка по выберите значения, а в разделе Порядок выберите от большего к меньшему и нажмите кнопку ОК. Чтобы удалить все скобки из столбца символов генов, прежде чем продолжить, выберите весь столбец, содержащий символы генов.

Выберите «Изменить», затем «Заменить» в раскрывающемся меню файла. Введите открытую скобку, звездочку, закрытую скобку, в которой найдите полосу окна замены, и арендуйте замену с пустой полосой. Выберите Заменить все, чтобы удалить все экземпляры скобок.

Чтобы определить обогащенные пути, скопируйте нужные символы генов в буфер обмена. Перейдите в ConsensusPathDB, затем выберите анализ набора генов на левой боковой панели веб-страницы, а затем анализ чрезмерной представленности. В поле «Вставьте список идентификаторов генов и белков» вставьте список генов.

Выберите символ гена в поле типа идентификатора гена/белка и нажмите «Продолжить». В разделе наборов на основе путей установите флажок рядом с путями, определенными базами данных путей. Выберите «Найти обогащенные наборы», чтобы получить список путей, содержащих гены во входном списке.

Выберите все обогащенные пути для визуализации в сети путей, выбрав каждое поле рядом с именами путей, или в разделе select в заголовке столбца над полями выбора щелкните все. Затем выберите Визуализировать выбранные наборы. Настройте фильтры относительного перекрытия и общих кандидатов, выбрав любое поле в верхней центральной части страницы и введя желаемый процент, относительное перекрытие или количество общих кандидатов, а затем нажмите кнопку Применить.

Чтобы определить обогащенные онтологии генов, скопируйте символы генов соответствующей группы в буфер обмена. Перейдите к инструменту анализа GO Enrichment в консорциуме Gene Ontology Consortium. В левой части страницы, под идентификаторами ваших генов, вставьте список символов генов в поле.

Под полем идентификаторов генов выберите термин «биологический процесс». Затем выберите danio rerio в поле «Перейти к условиям» и нажмите «Отправить». Проведите QRT-ПЦР и сравните с RNASeq, согласно текстовому протоколу.

Секвенирование экстрагированной РНК из личинок, которым вводили Morpholinos против alms1 или bbs1, выявило гены, которые были уникально повышающими и понижаемыми в моделях Альстрома и BBS, а также гены, которые были значительно изменены в обеих моделях. Для более четкого прояснения молекулярного профиля модели Альстрома были идентифицированы пути и онтологии генов, обогащенные дифференциально экспрессируемыми генами. Как показано здесь, был повышен уровень в 31 пути.

Помимо широкой группы метаболизма, наиболее подверженными влиянию путями были врожденная и адаптивная иммунная система, с 32 и 20 генами соответственно. Нисходящие сигнальные события рецепторов В-клеток также были обогащены. Несколько сигнальных путей также были обогащены среди активированных генов, что согласуется с ассоциацией синдрома Альстрома с первичной дисфункцией ресничек.

Кроме того, были усилены три пути, связанные с секрецией инсулина: жирные кислоты, связанные с GPR40, свободные жирные кислоты и ацетилхолин. Наконец, шесть членов GO были обогащены среди активированных генов в модели Альстрома, включая дифференцировку эритроцитов, гомеостаз эритроцитов, гомеостаз миелоидных клеток и гомеостатические процессы. После освоения пути и термина GO анализ может быть выполнен менее чем за час.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что выбор параметров пути и пороговых значений является наиболее важным фактором при интерпретации результатов сравнения экспрессии RNASeq. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как применение с мутантными линиями и транскриптомный анализ одиночных типов клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как транскриптомное профилирование типов клеток и изменения экспрессии генов под контролем конкретных генов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать транскриптомные данные рыбок данио, сгенерированные RNASeq, для идентификации значительных изменений экспрессии генов между экспериментальными образцами.