Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

Общая цель данного анализа RNASeq в образцах личинок zebrafish заключается в определении профилей экспрессии генов эмбрионов и личинок zebrafish, а также в количественном сравнительном анализе изменений экспрессии генов между образцами. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в любой области, где эмбрионы или личинки zebrafish являются информативными; например, как подавление одного целевого гена приводит к изменениям экспрессии генов или нарушению определенных путей по сравнению с другими условиями. Основным преимуществом данной методики является то, что zebrafish позволяют получать большое количество животных, что облегчает получение данных о транскриптоме всего организма.

Кроме того, выделение специфических типов клеток можно с легкостью осуществить путем сортировки трансгенных животных. Процедуры продемонстрируют Лейн Хостелли, аспирантка, и Джессика Несмит, постдок из моей лаборатории. Для начала вырастите эмбрионы до трехмесячного возраста, что соответствует репродуктивному созреванию.

Накануне сбора эмбрионов вечером отберите двух взрослых самцов и трех самок рыб интересующей линии и поместите их в разделенные перегородками нерестовые аквариумы со свежей системной водой. Следующим утром, после включения света, уберите перегородку и дайте рыбам спариться естественным путем до появления эмбрионов на дне аквариума. Собирайте эмбрионы с интервалом в 30 минут в отдельные чашки Петри со средой для эмбрионов до достижения необходимого количества.

Для определения стадии развития культивируйте эмбрионы группами по 50–75 штук в чашке Петри диаметром 10 см, чтобы обеспечить синхронность развития всех эмбрионов. Затем выдерживайте чашки при температуре 28.5 °C. Определяйте возраст эмбрионов по количеству сомитов после начала сегментации примерно до 24 часов после оплодотворения (HPF) и распределите эмбрионы по группам в зависимости от стадии развития.

После эвтаназии эмбрионов на нужном этапе согласно текстовому протоколу перенесите группу из 20 эмбрионов в промаркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем удалите из микроцентрифужной пробирки излишки среды для эмбрионов. Добавьте в пробирку 200 microliters лизирующего реагента.

Затем с помощью пестика механически гомогенизируйте эмбрионы. После этого добавьте еще 800 µL лизирующего реагента, чтобы довести общий объем до 1 mL. Для экстракции РНК добавьте лизирующий реагент в собранный образец и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 5 минут.

Добавьте 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл использованного реагента для лизиса и перемешайте содержимое пробирок путем переворачивания в течение 15 секунд. После инкубации образцов при комнатной температуре в течение двух-трех минут центрифугируйте их при 12 000 ×g и 4 °C в течение 15 минут. Перенесите отделенную водную фазу в новую пробирку и добавьте 0,5 мл изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента для лизиса.

После инкубации пробирок при комнатной температуре в течение 10 минут центрифугируйте образцы в течение 10 минут. Затем добавьте к РНК 75% ethanol и центрифугируйте пробирки при 7 500 ×g и 4 °C в течение 5 минут. Полностью удалите супернатант и дайте образцу высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Затем снова суспендируйте РНК в 15–30 µL воды, обработанной DEPC. Чтобы очистить высококачественную РНК после экстракции осадка и промывки образца согласно текстовому протоколу, используйте абсорбционный спектрофотометр для определения концентрации и чистоты экстрагированной РНК. Перед отправкой образцов РНК поставщику или в организацию для проведения RNASeq и анализа изменения экспрессии генов на основе количественного определения прочтений секвенирования убедитесь, что значение соотношения 260/230 составляет примерно 2,0.

Для сравнения одного экспериментального условия с контролем откройте данные о дифференциально экспрессируемых генах в программе для работы с электронными таблицами. Нажмите на стрелку выпадающего списка рядом с кнопкой сортировки и выберите функцию пользовательской сортировки в таблице. В появившемся окне отметьте поле в разделе «Столбец» и выберите сортировку по столбцу LFC.

В столбце «Сортировка» (sort) убедитесь, что выбраны «Значения» (values). В столбце «Порядок» (order) выберите сортировку от наибольшего к наименьшему и нажмите «ОК». Чтобы определить дифференциально экспрессируемые гены, обнаруженные в двух экспериментальных условиях, в электронной таблице сравнения экспериментальной группы с контрольной выберите первую ячейку пустого столбца.

Затем введите следующее уравнение в ячейку. Нажмите Enter или Return, чтобы выполнить вычисление. Выберите ячейку с уравнением и нажмите на квадрат в ее правом нижнем углу.

Удерживая кнопку мыши нажатой, перетащите выделенную область вниз по столбцу до последнего идентификатора признака (feature ID), чтобы скопировать формулу в каждую ячейку столбца. Снова выберите «Настраиваемая сортировка» (custom sort) и добавьте второй уровень сортировки, нажав на значок плюса в левом нижнем углу. На первом уровне в поле «Сортировать по» (sort by) в столбце выберите «дубликаты» (duplicate).

В поле «Сортировка по» (sort on) выберите «значения» (values), а в поле «Порядок» (order) выберите «от Z до A». На втором уровне, в разделе «Затем по» (then by), в поле «Столбец» (column) выберите LFC. В поле «Сортировка по» (sort on) выберите «значения» (values), а в поле «Порядок» (order) выберите «от наибольшего к наименьшему» и нажмите «ОК». Чтобы удалить скобки в столбце с символами генов перед продолжением, выделите весь столбец, содержащий символы генов.

Выберите «Правка», затем «Заменить» в выпадающем меню файла. Введите открывающую скобку, звездочку, закрывающую скобку в поле «Найти» окна замены, а поле «Заменить на» оставьте пустым. Выберите «Заменить все», чтобы удалить все скобки.

Для определения обогащенных путей скопируйте нужные символы генов в буфер обмена. Перейдите в ConsensusPathDB, затем выберите анализ наборов генов (gene set analysis) на левой боковой панели веб-страницы, а затем анализ избыточного представления (over-representation analysis). Вставьте список генов в поле «paste a list of gene and protein identifiers».

Выберите «gene symbol» в поле типа идентификатора гена/белка и нажмите «proceed». В разделе наборов на основе путей (pathway-based sets) отметьте флажком пункт «pathways as defined by pathway databases». Нажмите «find enriched sets», чтобы получить список путей, содержащих гены из введенного списка.

Выберите все обогащенные пути для визуализации в сети путей, отметив флажки рядом с названиями путей или нажав «all» (все) в разделе «select» (выбрать) в заголовке столбца над флажками выбора. Затем выберите «visualize selected sets» (визуализировать выбранные наборы). Настройте фильтры относительного перекрытия и общих кандидатов, выбрав соответствующий флажок в верхней центральной части страницы и введя желаемый процент, относительное перекрытие или количество общих кандидатов, после чего нажмите «apply» (применить).

Чтобы определить обогащенные онтологии генов, скопируйте символы генов соответствующей группы в буфер обмена. Перейдите к инструменту анализа обогащения GO (GO Enrichment analysis) в Gene Ontology Consortium. В левой части страницы в поле «your gene IDs here» вставьте список символов генов.

В поле «Gene IDs» выберите GO-термин «biological process». Затем в поле «GO terms» выберите danio rerio и нажмите «submit». Выполните QRT-PCR и сравните результаты с данными RNASeq в соответствии с текстовым протоколом.

Секвенирование экстрагированной РНК из личинок, в которых были введены морфолино против alms1 или bbs1, позволило выявить гены, экспрессия которых была уникально повышена или понижена в моделях синдрома Альстрема и BBS, а также гены, значительно изменившиеся в обеих моделях. Для более точного выяснения молекулярного профиля модели синдрома Альстрема были определены пути и генные онтологии, обогащенные в дифференциально экспрессируемых генах. Как показано здесь, в общей сложности было активировано 31 путь.

Помимо общих метаболических процессов, наиболее выраженные изменения наблюдались в путях врожденного и адаптивного иммунитета, где было задействовано 32 и 20 генов соответственно. Также было отмечено обогащение событий нижележащего сигналинга B-клеточного рецептора. Среди активированных генов также было выявлено обогащение нескольких сигнальных путей, что согласуется со связью синдрома Альстрема с дисфункцией первичных ресничек.

Кроме того, была отмечена повышенная экспрессия трех путей, связанных с секрецией инсулина: связывание жирных кислот с GPR40, свободные жирные кислоты и ацетилхолин. Наконец, среди генов с повышенной экспрессией в модели синдрома Альстрема были обогащены шесть терминов GO, включая дифференцировку эритроцитов, гомеостаз эритроцитов, гомеостаз миелоидных клеток и гомеостатические процессы. После освоения метода анализ путей и терминов GO может быть выполнен менее чем за час.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что выбор параметров пути и пороговых значений является наиболее важным аспектом при интерпретации результатов сравнения экспрессии RNASeq. После этой процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы могут быть применены другие методы, такие как использование мутантных линий и транскриптомный анализ отдельных типов клеток, что позволит провести профилирование транскриптома типов клеток и изучить изменения экспрессии генов под контролем специфических генов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать транскриптомные данные zebrafish, полученные методом RNASeq, для выявления значимых изменений экспрессии генов между экспериментальными образцами.