Спаривание и стадирование яиц: метод получения эмбрионов и их сортировки по стадиям развития

- Начните с емкости для случки, емкости со съемной вставкой, которая позволяет яйцам проваливаться сквозь них. Добавьте двух самцов и трех взрослых самок рыб в разделенный брачный аквариум вечером перед сбором эмбрионов, чтобы они акклиматизировались друг к другу на ночь.

На следующее утро пересадите рыб в новый резервуар для спаривания, содержащий воду из системы, и снимите разделитель. Подождите от 15 до 30 минут, чтобы дать рыбе время для спаривания и нереста.

Теперь соберите эмбрионы и храните их в чашке Петри, содержащей среду для эмбрионов Хэнка. Выращивайте их при температуре 28,5 градусов по Цельсию на протяжении всего протокола. Изучите морфологию эмбрионов под исследуемым микроскопом.

Вы заметите несколько особенностей развития. Расщепление бластодиска приводит к образованию нескольких клеток. Бластодерма имеет форму перевернутой чашечки над желточной клеткой. Параксиальные сегменты мезодермы развиваются на дорсальной части эмбриона и так далее.

Через 24 часа после оплодотворения просто отсортируйте эмбрионы по общей длине тела. В примере протокола мы настроим спаривание трансгенных рыб-репортеров mCherry и отсортируем полученные эмбрионы.

- Для начала культивируйте эмбрионы до трехмесячного возраста, который является репродуктивной зрелостью. Отделите двух взрослых самцов и трех самок рыб от нужного штамма в отдельные брачные резервуары с пресной водой системы вечером накануне сбора эмбрионов. На следующее утро после того, как зажгется свет, снимите разделитель и дайте рыбам спариваться естественным образом, пока на дне аквариума не будут замечены эмбрионы.

Соберите эмбрионы с интервалом в 30 минут и разделите чашки Петри с эмбриональной средой до тех пор, пока не будет собрано нужное количество. Чтобы определить стадию эмбрионов, культивируйте их в группах от 50 до 75 на 10-сантиметровую чашку Петри, чтобы обеспечить согласованное время развития всех эмбрионов. Затем держите тарелки при температуре 28,5 градусов по Цельсию.

Измерьте возраст эмбриона с помощью сомитного числа после сегментации примерно через 24 часа после оплодотворения или HPF и разделите эмбрионы в зависимости от возраста развития.