Поверхностная инженерия панкреатических островков с гепаринизированным StarPEG Нанопокрытия

Этот метод может помочь решить основные проблемы при трансплантации островковых клеток поджелудочной железы, такие как иммуноотторжение, реваскуляризация островков после трансплантации и выживаемость. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что этот простой в использовании подход позволяет проводить поверхностную инженерию живых клеток, изменяя клеточный ландшафт островка поджелудочной железы, что улучшает функцию трансплантата, выживаемость и, в конечном итоге, терапевтическую эффективность трансплантации островковых клеток. Применение этого метода распространяется и на клеточную терапию, поскольку терапевтический результат клеточной терапии также ограничен низким удержанием клеток и низкой выживаемостью.

Эту процедуру демонстрирует Цзинъи Янг, аспирант из моей лаборатории. Сначала взвесьте 6,9 грамма гепарина и растворите его в 2 миллилитрах ледяной деионизированной воды в пробирке Эппендорфа. Растворите 0,23 грамма NHS в 0,5 миллилитрах ледяной деионизированной воды в пробирке Эппендорфа.

Затем растворите 0,77 грамма EDC в 0,5 миллилитрах ледяной деионизированной воды в конической трубке объемом 50 миллилитров. Смешайте растворы NHS и EDC в конической трубке объемом 50 миллилитров. Оставив смешанный раствор при комнатной температуре на 30 минут, центрифугируйте его при 12 000 об/мин в течение 10 минут для удаления избытка EDC и NHS.

После этого добавьте в раствор 30 миллилитров холодного этанола и центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 10 минут. Теперь добавьте 1 миллилитр 10% starPEG MI в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем добавьте 0,67 миллилитра 10% раствора гепарина NHS в ту же 50-миллилитровую коническую трубку.

Поместите смешанный раствор в инкубатор при температуре 25 градусов Цельсия на 20 минут до получения вязкого прозрачного раствора. Вручную отоберите 200 предварительно извлеченных мышиных островков под микроскопом для вскрытия и переложите в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 500 микролитров PBS в островки и центрифугируйте при 1 200 об/мин в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость, добавьте 250 микролитров раствора гепарина ПЭГ и поместите смесь на лед на 10 минут. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы островки хорошо смешались с раствором гепарина ПЭГ. После этого центрифугируйте смесь при 1, 200 об/мин в течение одной минуты.

Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте 500 микролитров PBS. Пипеткой вверх и вниз хорошо перемешайте. После центрифугирования при 1,200 об/мин в течение одной минуты удалите надосадочную жидкость и оставьте островки для дальнейшего использования.

Далее добавьте от одного до двух миллилитров RPM I 1640, дополненных 10% FBS к покрытым глазками островкам. И перенесите эти островки в незаряженную стерильную чашку для бактериальной культуры. Наконец, наблюдайте за морфологией и флуоресцентными сигналами островков, покрытых FAM-гепарином-ПЭГ, под инвертированным флуоресцентным микроскопом.

Характерные пики гепарина, соответствующие группам HYDROXAL, наблюдались в спектре ИК-Фурье нанопокрытия гепарина-ПЭГ. Уменьшение амплитуды этих пиков представляет собой конъюгацию между амидными группами звездообразного ПЭГ ИМ и карбональной группой гепарина. Пик, соответствующий вибрации растяжения амида карбонала, также был снижен, что указывает на достаточную реакцию между группами карбоксилата гепарина с сукцинимидальным суксонатом и амином со звездчатым ПЭГ ИМ.

Сканирование данных электронной микроскопии показывает сильно взаимосвязанную пористую структуру нанопокрытия гепарин-ПЭГ, что позволяет предположить, что оно может быть пригодным для выживания клеток во время доставки in vivo. Тонкий слой нанопокрытия, показанный зеленой флуоресценцией, равномерно наносился по поверхности покрытых островков, не вызывая заметных изменений в объеме или размере островков. Мышиный островок, покрытый гепарином-ПЭГ, продемонстрировал устойчивую жизнеспособность островков в культуре.

Значительно более прогрессирующее сосудистое образование было обнаружено у эндотелиальных клеток островков, которые были совместно культивированы с островками, покрытыми гепарином-ПЭГ, на что указывали удлиненные микрососудоподобные структуры и сетчатые сосудистые структуры. Низкий уровень секреции инсулина наблюдался во всех группах лечения при перфузии островков физиологическим раствором соли с добавлением субстимулирующего уровня глюкозы. При стимуляции островков сверхфизиологическим уровнем глюкозы наблюдалось увеличение секреции инсулина.

После освоения покрытие может быть выполнено за минуту, если оно выполнено правильно для сохранения жизнеспособности островков.