Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок

Этот метод может помочь ученым максимально продуктивно использовать островки поджелудочной железы для оценки множественных результатов на каждом образце в его естественной тканевой архитектуре. Основное преимущество этого нового метода заделки заключается в том, что островки равномерно распределены по четко определенной области, размещая множество островков в плоскости разреза, что оптимизирует экспериментальный выход из этого материала с низким содержанием залегания. Демонстрировать процедуру будет доктор Яхуэй Конг, научный сотрудник моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, используйте наконечник для пипетки p200 с низким связыванием и откалиброванную сетку под стереомикроскопом, чтобы вручную выбрать 250 островковых эквивалентов. Перенося их в каждую 1,5 миллилитровую микрофужную пробирку с низким уровнем связывания. Дайте островкам осесть на дно микрофуговой пробирки.

Затем с помощью пипетки со свежим наконечником p200 осторожно удалите большую часть надосадочной жидкости. Убедитесь, что вы не удаляете островки. Добавьте один миллилитр PBS и центрифугируйте в центрифуге с качающимся ведром, пока скорость не достигнет 200-кратной скорости гравитации, а затем остановите вращение.

Удалите надосадочную жидкость. Повторите весь процесс стирки PBS в общей сложности два цикла стирки. Затем добавьте 500 микролитров либо 10% раствора формалина, либо 4% свежеприготовленного параформальдегида.

Дайте образцу зафиксироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого с помощью пипетки с наконечником p200 снимите фиксатор. Добавьте один миллилитр PBS и центрифугируйте до тех пор, пока скорость не достигнет 200 кратной силы тяжести, а затем остановите вращение.

Удалите надосадочную жидкость, а затем повторите весь процесс стирки PBS еще раз, в общей сложности два цикла стирки. Приготовьте желаемый гель в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра, как указано в текстовом протоколе. Затем поместите эти микроцентрифужные пробирки в термоблок при температуре 70 градусов Цельсия, чтобы нагреть гель.

С помощью отрезанного наконечника микропипетки переложите 10 микролитров шариков агарозного синего цвета на образец в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте один миллилитр PBS в бусины, затем центрифугируйте при 800-кратном давлении в течение одной минуты. Снимите PBS и повторите промывку еще раз.

После второй стирки снова суспензируйте бусины в соответствующем количестве PBS. Центрифугируйте пробирки с островками до тех пор, пока скорость не достигнет 200-кратной скорости гравитации, а затем остановите вращение. Удалите большую часть надосадочной жидкости.

С помощью ножниц отрежьте конец одного наконечника микропипетки объемом 10 микролитров для каждого образца. Добавьте 10 микролитров шариков в каждую островковую трубку, используя чистый отрезанный кончик для каждого образца. Затем центрифугируйте до тех пор, пока скорость не достигнет скорости в 200 раз больше силы тяжести.

После этого используйте неразрезанные 200 микролитров, а затем 10 микролитров, чтобы удалить как можно больше PBS. Пометьте предметные стекла микроскопа для идентификации образца и положите их на стол рядом с нагревательным блоком с подогретым гелем. С помощью ножниц отрежьте концы от нескольких кончиков микропипеток с низким связыванием на образец.

С помощью микропипетки, оснащенной отрезанным наконечником, добавьте теплый гель в пробирку, содержащую островки и шарики. Немедленно перемешайте, не допуская образования пузырьков. Нанесите эту смесь на предметное стекло, образуя диск у края предметного стекла, оставляя при этом место для внешнего гелевого кольца.

Затем слегка постучите по предметному стеклу несколько раз, чтобы оседать островки и бусины. Добавьте 20 микролитров теплого геля в пробирку с образцом и смешайте новый гель с оставшимися островками и шариками. Нанесите эту смесь на предметное стекло, окружающее исходный диск.

Повторяйте по мере необходимости, используя свежие предварительно вырезанные наконечники для каждого применения, пока диск не достигнет желаемого размера и толщины. Обязательно подготовьте каждый диск по отдельности и отслеживайте порядок образцов, если размещаете несколько дисков с каждой стороны. Далее поместите горки на ровную поверхность влажного льда и накройте их.

Дайте предметным стеклам отдохнуть 10 минут или пока гель не застынет. Затем снимите слайды, убедившись, что задняя часть каждого из них высушена. Пометьте биопсию, обработку и встраивание тканевой кассеты для каждого образца.

С помощью тупого края бритвенного лезвия осторожно надавите на диск в каждом направлении, чтобы освободить его от стекла. Когда диск легко сдвинется, медленно оттолкните диск от предметного стекла и положите диск плоской стороной вниз прямо на бумагу. Может быть трудно сохранить отдельные диски неповрежденными, когда они передвигаются со стекла на бумагу.

Если в диске появилась складка, дайте ему вернуться в исходное положение, добавьте еще геля и повторно нанесите гель на предметное стекло. Оберните бумагу вокруг диска, чтобы предотвратить смещение. Перенесите это в кассету, а затем закройте кассету.

Погрузите кассету в стакан, наполненный PBS. В этом исследовании используется модифицированный метод заделки на основе гелевого диска для эффективного получения высокого выхода островков на секцию. Морфология островков грызунов заметно более сохранна после восстановления в островковой среде с гладкой округлой поверхностью и компактной сферической формой.

Тот факт, что морфология островков человека схожа, независимо от того, внедрены ли они в день прибытия или после восстановления после отгрузки в течение ночи, может быть связан с тем, что островки восстанавливаются от изоляционного напряжения до отгрузки. Для сравнения, парафиновые срезы, полученные с помощью старого метода микротрубок, имеют меньшую площадь поперечного сечения ткани с меньшим количеством островков на срез и с плотно упакованными островками и бусинами. Как показано здесь, этот метод позволяет получать высококачественные островковые срезы для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Окрашивание инсулином и глюкагоном показывает разнообразный состав и гетерогенность архитектуры островков, демонстрируя известные различия в архитектуре между островками человека, мыши и крысы. Эти изображения также представляют собой серийные разрезы тех же островков. Демонстрация того, что этот метод способен получать несколько разрезов с одних и тех же островков.

После освоения этой технологии она экономит время по сравнению с микроцентрифугой. Формование диска на плоской поверхности, а не в виде трубки, облегчает физическую передачу диска в кассету для обработки. Хотя этот метод может дать представление о биологии островков, он также может быть применен к другим клеточным блокам или рыхлым тканям, которые трудно разрезать.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании геля небольшого объема, чтобы сконцентрировать ткань на небольшой площади и сформировать диск на плоской поверхности. Также важно использовать микроцентрифужные пробирки с низким связыванием и наконечники для пипеток для повышения выхода тканей. Этот метод открывает исследователям в области биологии островков путь к изучению состава и гетерогенности типов клеток, межклеточного взаимодействия и регуляции генов в целых культивируемых островках в их родной архитектуре.

Возможность создания 10 или более секций, содержащих множество островков, из одного экспериментального условия позволяет количественно оценить несколько результатов на одном и том же материале, повышая эффективность эксперимента. Применение этого метода к образцам тканей с ограниченным количеством может принести пользу и в других областях. Возможно, потребуется изменить элементы этой процедуры в соответствии с потребностями пользователя.

Интенсивность фиксации и деление должны быть оптимизированы. С помощью этой техники можно создать более толстый или большой диск. Возможно, потребуется уложить простые этапы обработки для встраивания, и их следует оптимизировать.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить высококачественный агарозный клеточный блок для парафиновых срезов цельных культивируемых островков поджелудочной железы.