Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок
29 июня 2018 г.
Ex vivo поджелудочной островок исследования имеют большое значение для исследования мочеизнурения. Существующие методы для изучения культивировали островков в их родной 3-мерной архитектуры времени, неэффективны и редко используемых. Эта работа описывает новый, простой и эффективный метод для создания высококачественных парафиновых срезах вся культивировали островков.
Этот метод может помочь ученым максимально продуктивно использовать островки поджелудочной железы для оценки множественных результатов на каждом образце в его естественной тканевой архитектуре. Основное преимущество этого нового метода заделки заключается в том, что островки равномерно распределены по четко определенной области, размещая множество островков в плоскости разреза, что оптимизирует экспериментальный выход из этого материала с низким содержанием залегания. Демонстрировать процедуру будет доктор Яхуэй Конг, научный сотрудник моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, используйте наконечник для пипетки p200 с низким связыванием и откалиброванную сетку под стереомикроскопом, чтобы вручную выбрать 250 островковых эквивалентов. Перенося их в каждую 1,5 миллилитровую микрофужную пробирку с низким уровнем связывания. Дайте островкам осесть на дно микрофуговой пробирки.
Затем с помощью пипетки со свежим наконечником p200 осторожно удалите большую часть надосадочной жидкости. Убедитесь, что вы не удаляете островки. Добавьте один миллилитр PBS и центрифугируйте в центрифуге с качающимся ведром, пока скорость не достигнет 200-кратной скорости гравитации, а затем остановите вращение.
Удалите надосадочную жидкость. Повторите весь процесс стирки PBS в общей сложности два цикла стирки. Затем добавьте 500 микролитров либо 10% раствора формалина, либо 4% свежеприготовленного параформальдегида.
Дайте образцу зафиксироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого с помощью пипетки с наконечником p200 снимите фиксатор. Добавьте один миллилитр PBS и центрифугируйте до тех пор, пока скорость не достигнет 200 кратной силы тяжести, а затем остановите вращение.
Удалите надосадочную жидкость, а затем повторите весь процесс стирки PBS еще раз, в общей сложности два цикла стирки. Приготовьте желаемый гель в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра, как указано в текстовом протоколе. Затем поместите эти микроцентрифужные пробирки в термоблок при температуре 70 градусов Цельсия, чтобы нагреть гель.
С помощью отрезанного наконечника микропипетки переложите 10 микролитров шариков агарозного синего цвета на образец в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте один миллилитр PBS в бусины, затем центрифугируйте при 800-кратном давлении в течение одной минуты. Снимите PBS и повторите промывку еще раз.
После второй стирки снова суспензируйте бусины в соответствующем количестве PBS. Центрифугируйте пробирки с островками до тех пор, пока скорость не достигнет 200-кратной скорости гравитации, а затем остановите вращение. Удалите большую часть надосадочной жидкости.
С помощью ножниц отрежьте конец одного наконечника микропипетки объемом 10 микролитров для каждого образца. Добавьте 10 микролитров шариков в каждую островковую трубку, используя чистый отрезанный кончик для каждого образца. Затем центрифугируйте до тех пор, пока скорость не достигнет скорости в 200 раз больше силы тяжести.
После этого используйте неразрезанные 200 микролитров, а затем 10 микролитров, чтобы удалить как можно больше PBS. Пометьте предметные стекла микроскопа для идентификации образца и положите их на стол рядом с нагревательным блоком с подогретым гелем. С помощью ножниц отрежьте концы от нескольких кончиков микропипеток с низким связыванием на образец.
С помощью микропипетки, оснащенной отрезанным наконечником, добавьте теплый гель в пробирку, содержащую островки и шарики. Немедленно перемешайте, не допуская образования пузырьков. Нанесите эту смесь на предметное стекло, образуя диск у края предметного стекла, оставляя при этом место для внешнего гелевого кольца.
Затем слегка постучите по предметному стеклу несколько раз, чтобы оседать островки и бусины. Добавьте 20 микролитров теплого геля в пробирку с образцом и смешайте новый гель с оставшимися островками и шариками. Нанесите эту смесь на предметное стекло, окружающее исходный диск.
Повторяйте по мере необходимости, используя свежие предварительно вырезанные наконечники для каждого применения, пока диск не достигнет желаемого размера и толщины. Обязательно подготовьте каждый диск по отдельности и отслеживайте порядок образцов, если размещаете несколько дисков с каждой стороны. Далее поместите горки на ровную поверхность влажного льда и накройте их.
Дайте предметным стеклам отдохнуть 10 минут или пока гель не застынет. Затем снимите слайды, убедившись, что задняя часть каждого из них высушена. Пометьте биопсию, обработку и встраивание тканевой кассеты для каждого образца.
С помощью тупого края бритвенного лезвия осторожно надавите на диск в каждом направлении, чтобы освободить его от стекла. Когда диск легко сдвинется, медленно оттолкните диск от предметного стекла и положите диск плоской стороной вниз прямо на бумагу. Может быть трудно сохранить отдельные диски неповрежденными, когда они передвигаются со стекла на бумагу.
Если в диске появилась складка, дайте ему вернуться в исходное положение, добавьте еще геля и повторно нанесите гель на предметное стекло. Оберните бумагу вокруг диска, чтобы предотвратить смещение. Перенесите это в кассету, а затем закройте кассету.
Погрузите кассету в стакан, наполненный PBS. В этом исследовании используется модифицированный метод заделки на основе гелевого диска для эффективного получения высокого выхода островков на секцию. Морфология островков грызунов заметно более сохранна после восстановления в островковой среде с гладкой округлой поверхностью и компактной сферической формой.
Тот факт, что морфология островков человека схожа, независимо от того, внедрены ли они в день прибытия или после восстановления после отгрузки в течение ночи, может быть связан с тем, что островки восстанавливаются от изоляционного напряжения до отгрузки. Для сравнения, парафиновые срезы, полученные с помощью старого метода микротрубок, имеют меньшую площадь поперечного сечения ткани с меньшим количеством островков на срез и с плотно упакованными островками и бусинами. Как показано здесь, этот метод позволяет получать высококачественные островковые срезы для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания.
Окрашивание инсулином и глюкагоном показывает разнообразный состав и гетерогенность архитектуры островков, демонстрируя известные различия в архитектуре между островками человека, мыши и крысы. Эти изображения также представляют собой серийные разрезы тех же островков. Демонстрация того, что этот метод способен получать несколько разрезов с одних и тех же островков.
После освоения этой технологии она экономит время по сравнению с микроцентрифугой. Формование диска на плоской поверхности, а не в виде трубки, облегчает физическую передачу диска в кассету для обработки. Хотя этот метод может дать представление о биологии островков, он также может быть применен к другим клеточным блокам или рыхлым тканям, которые трудно разрезать.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании геля небольшого объема, чтобы сконцентрировать ткань на небольшой площади и сформировать диск на плоской поверхности. Также важно использовать микроцентрифужные пробирки с низким связыванием и наконечники для пипеток для повышения выхода тканей. Этот метод открывает исследователям в области биологии островков путь к изучению состава и гетерогенности типов клеток, межклеточного взаимодействия и регуляции генов в целых культивируемых островках в их родной архитектуре.
Возможность создания 10 или более секций, содержащих множество островков, из одного экспериментального условия позволяет количественно оценить несколько результатов на одном и том же материале, повышая эффективность эксперимента. Применение этого метода к образцам тканей с ограниченным количеством может принести пользу и в других областях. Возможно, потребуется изменить элементы этой процедуры в соответствии с потребностями пользователя.
Интенсивность фиксации и деление должны быть оптимизированы. С помощью этой техники можно создать более толстый или большой диск. Возможно, потребуется уложить простые этапы обработки для встраивания, и их следует оптимизировать.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить высококачественный агарозный клеточный блок для парафиновых срезов цельных культивируемых островков поджелудочной железы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен новый метод получения высококачественных парафиновых срезов целых культивируемых островков поджелудочной железы, что расширяет возможности их использования в исследованиях диабета. Данная методика позволяет эффективно оценивать множество показателей, сохраняя при этом естественную трехмерную архитектуру островков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Исследование сахарного диабета
Теоретические основы
- Исследования островков панкреатических островков ex vivo имеют решающее значение для понимания диабета.
- Традиционные методы изучения островков часто неэффективны и недостаточно используются.
- Сохранение нативной архитектуры островков необходимо для точной оценки.
- Этот новый метод направлен на повышение выхода и качества результатов экспериментов.
Цель исследования
- Представить простой и эффективный метод заливки островков в среду.
- Оптимизировать выход экспериментальных данных при работе с ограниченным количеством материала островков поджелудочной железы.
- Обеспечить возможность оценки нескольких показателей на каждом образце.
Используемые методы
- Использование наконечника для дозатора p200 с низким уровнем связывания для отбора островков.
- Ручной отбор 250 островковых эквивалентов под стереомикроскопом.
- Перенос островков в микроцентрифужные пробирки с низким уровнем связывания.
- Оседание островков для обеспечения оптимального сечения.
Основные результаты
- Новый метод заливки обеспечивает равномерное распределение островков.
- Множество островков располагается в плоскости среза, что повышает выход материала.
- Процедуру демонстрирует доктор Yahui Kong.
- Усовершенствованная методика способствует достижению лучших результатов в исследованиях диабета.
Выводы
- Данный метод значительно расширяет возможности изучения островков поджелудочной железы.
- Он обеспечивает более эффективный подход к исследованию островков.
- Будущие исследования могут извлечь пользу из этой улучшенной методики.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод решает проблему ограниченной доступности островков поджелудочной железы в исследованиях диабета, обеспечивая получение большого количества парафиновых срезов культивируемых островков с сохранением их естественной архитектуры. Он способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет возможности проведения клеточно-специфического анализа и измерения множественных показателей в одном и том же образце, что повышает прогностическую достоверность при доклинической валидации мишеней. Этот подход улучшает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинических стадий, поддерживая целостность островков в ходе экспериментального воздействия и анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью измерений, специфичных для определенных типов клеток, в сохранной архитектуре островков.
- Практическая ценность: снижает потерю материала и увеличивает количество пригодных для анализа срезов из одной подготовки островков, что повышает эффективность при работе с образцами в ограниченном количестве.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые срезы, подходящие для гистологического и иммунофлуоресцентного скрининга влияния соединений на функцию островков.
- Практическая ценность: Обеспечивает масштабируемость анализа за счет получения более 10 срезов из одного блока островков, что позволяет проводить параллельный анализ идентичного биологического материала.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет естественные взаимодействия между клетками островков, а также между клетками и субстратом, что позволяет проводить функциональные оценки, релевантные для заболевания, в доклинических моделях.
- Практическая ценность: Обеспечивает однородность поперечных срезов для лонгитюдного анализа реакций островков на экспериментальные условия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств, обеспечивая возможность детального фенотипического анализа после воздействия соединений, поддерживая идентификацию перспективных соединений-лидеров за счет показателей с сохранением архитектуры ткани и обосновывая решения о переходе к доклиническим исследованиям посредством количественного многопараметрического профилирования островков.
- Открытия в биологии: Способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов за счет сохранения архитектуры островков при экспериментальных манипуляциях и анализе.
- Скрининг: Повышает готовность и воспроизводимость анализа благодаря равномерному распределению островков и высокому выходу срезов из одного образца.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение зависимых переменных посредством серийного срезания для получения коррелирующих структурных и молекулярных показателей.
- Трансляционные исследования: Способствует преемственности доклинических исследований, позволяя оценивать ответы целых островков, которые отражают поведение нативной ткани.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность повторного использования метода заливки, применимого к другим хрупким или низкопродуктивным моделям тканей, помимо островков поджелудочной железы.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет снижения механистической неопределенности благодаря использованию данных с сохранением архитектуры, специфичных для определенного типа клеток.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость процесса секционирования островков в различных исследовательских группах и лабораториях.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), позволяя проводить многопараметрическую оценку результатов на основе ограниченного количества высокоценных биологических образцов.
- Влияние на портфель проектов: Улучшает приоритезацию с учетом рисков за счет использования надежных, количественно определяемых биомаркеров функции и токсичности на основе островков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах гистологической заливки и срезания для оптимальной работы с гелем и формирования дисков.
- Необходимо наличие стандартного гистологического оборудования, включая термоблоки, центрифуги, микротомы и платформы для окрашивания.
- Требуется межгрупповая стандартизация приготовления геля и размеров дисков для обеспечения единообразия срезов.
- Предусматривается необходимость адаптации метода при его применении к другим хрупким тканям с различными размерами, плотностью или степенью ломкости.
- Включает практические ограничения, связанные с оптимизацией интенсивности фиксации и толщины диска для предотвращения появления артефактов и обеспечения качества срезов.
