Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение

Общая цель химической функционализации поверхности наночастиц HEV заключается в обеспечении воспроизводимого и согласованного подхода к конъюгации молекул-мишеней нацеливания иммуногенных, терапевтических и диагностических молекул на поверхность наночастиц HEV для целей диагностики и лечения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области наномедицины, такие как как возможность мониторинга улучшенного нацеливания на рак и распространение нанотерапевтических средств. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обладает высокой воспроизводимостью, эффективностью и гораздо проще в достижении по сравнению с генной инженерией.

Демонстрировать процедуры будут Мишель Нгуен и Иван Руис, научные сотрудники нашей лаборатории. Начните этот протокол с производства и очистки наночастиц вируса гепатита Е, как описано в текстовом протоколе. Разбавьте образцы наночастиц HEV до 0,5-2 миллиграммов на миллилитр с 10 миллимолярными MES, pH 6,2 для визуализации TEM.

Ионизируйте решетки с углеродным покрытием с помощью 40 миллиамперного тлеющего разряда в течение 30 секунд, чтобы получить гидрофильную углеродную поверхность. Гидрофильная углеродная поверхность решеток может сохраняться только в течение 30 минут после обработки тлеющим разрядом. После ионизации возьмите сетку и пинцет и добавьте в сетку два микролитра образца наночастицы HEV.

Через 15-30 секунд промокните сетку фильтровальной бумагой. Затем сразу же промойте сетку двойной дистиллированной водой и снова промокните фильтровальной бумагой. Сразу добавляем в сетку два микролитра двухпроцентного уранилацетата.

Через 15 секунд промокните сетку фильтровальной бумагой. Высушите сетки для образцов, поместив их в электронный осушитель воздуха в сухой шкаф на ночь. В зависимости от образца для визуализации и определения характеристик структуры может потребоваться криогенная электронная микроскопия или крио-ЭМ.

Перенесите сетку в ПЭМ и получите изображение с увеличением от 10 до 80 К. Наночастицы HEV появляются в ПЭМ в виде пустых икосаэдрических белков диаметром около 27 нанометров из-за отсутствия вирусной РНК. Чтобы выполнить одноэтапную конъюгацию наночастиц HEV и связанного с малеимидом биотина, сначала нанесите наночастицы HEV на мини-диализные установки.

Диализ наночастиц на 0,01 моляра PBS pH 7,4 при комнатной температуре в течение одного часа в соответствии с протоколом производителя. После диализа наночастицы HEV переносят в пробирки объемом 1,5 миллилитра и измеряют концентрацию белка на глубине 280 нанометров с помощью спектрофотометра. Смешайте наночастицы в дозе один миллиграмм на миллилитр с равным количеством 100 микромольного малеимида биотина и 0,01 молярного PBS pH 7,4, чтобы получить соотношение один к пяти молярам.

После реакции в течение ночи при четырех градусах Цельсия удалите несвязанный малеимимид биотин с помощью процедуры спиновой обессоливающей колонны в соответствии с протоколом производителя. Проанализируйте образцы с помощью стандартной редукционной страницы SDS. Используя стандартные процедуры, готовят хемилюминесцентный вестерн-блот с использованием HRP-связанного стрептавидина и захватывают хемилюминесцентный сигнал с помощью рентгеновской пленки.

Чтобы выполнить двухступенчатую конъюгацию лиганда, специфичного для клеток рака молочной железы, LXY30, с поверхностным цистеином на наночастицах HEV, сначала нанесите наночастицы на мини-диализные установки и диализируйте против 0,01 молярного PBS pH 7,4 при комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите наночастицы HEV в пробирки объемом 1,5 миллилитра и измерьте концентрацию белка на 280 нанометрах с помощью спектрофотометра. Затем соедините 650 микромолярный малеимид азид и 650 микромолярный алкин LXY30 с 200 микролярным сульфатом меди и одной миллимолярной аскорбиновой кислотой.

Это образует малеимид-сцепленный LXY 30 на 650 микромолярах. Инкубируйте смесь при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день смешайте наночастицы HEV до одного миллиграмм на миллилитр с примерно 10% объема связанного с малеимидом LXY 30, чтобы получить соотношение один к трем молярам.

Реагируйте ночью при четырех градусах Цельсия. Из-за относительно высокой концентрации малеимида LXY 30 конечные концентрации реагентов, таких как сульфат меди, снижаются примерно в 10 раз после смешивания. Чтобы избежать их повреждения наночастицами вируса гепатита Е, еще одним вариантом является метод безмедного вклада.

Удалите несвязанный малеимид щелчком LXY 30 с помощью отжимной обессоливающей колонны в соответствии с протоколом производителя. Храните наночастицы LXY 30-linked HEV при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы выполнить одноэтапное сопряжение наночастиц LXY 30 HEV и флуоресцентной метки Cy5,5, сначала смешайте связанные с LXY 30 наночастицы до одного миллиграмм на миллилитр с равным объемом флуоресцентной метки Cy5,5, чтобы получить соотношение один к пяти молярам.

После реакции смеси в течение ночи при четырех градусах Цельсия удалите несвязанный Cy5.5 NHS с помощью процедуры спиновой обессоливающей колонны в соответствии с протоколом производителя. Храните наночастицы HEV, связанные с LXY 30 Cy5.5, при температуре четыре градуса Цельсия. Были предприняты попытки использовать два метода функционализации наночастиц HEV методом LXY 30 для нацеливания на опухолевые клетки.

Когда наночастицы HEV 573C сначала связывались с азидом малеимида, а затем проводилась химическая реакция клик-химии с алкином LXY 30, наночастицы HEV 573C, по-видимому, разбирались под наблюдением ПЭМ. Тем не менее, первоначальная химическая реакция клика между алкином LXY 30 и азимидом малеимида с образованием связанного с малеимидом LXY 30 с последующей конъюгацией для помощи модифицированным наночастицам HEV не повлияла на его структуру, и наночастицы HEV 573C остались нетронутыми. LXY 30 и Cy5.5-связанные наночастицы HEV наносили на культивируемые клетки рака молочной железы и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии.

Флуоресцентные изображения в ближнем инфракрасном диапазоне, полученные с помощью конфокальной микроскопии, показывают, что наночастицы HEV, связанные с LXY 30 Cy5.5, имеют более высокую аффинность связывания для повышенной интернализации в клетках рака молочной железы MDA MB 231 по сравнению с наночастицами HEV, связанными с Cy5.5. Применение этого метода распространяется на изучение мультимодальных таргетных и терапевтических молекул, которые позволяют точно нацеливаться и диагностировать опухоль без повреждения нормальных клеток. Хотя этот метод может дать представление о раке и нацеливании на опухоль с помощью химической модуляции поверхности, он может быть применен для ранней диагностики рака, скрининга и лечения под визуальным контролем.