Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки

Общая цель этой процедуры заключается в определении способности сывороток, собранных у макак-резусов, инфицированных вирусом Зика, опосредуть антителозависимое усиление инфекции, вызванной вирусом денге, in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с антителозависимым усилением инфекции денге, вызванной перекрестно-реактивными антителами, вызванными вирусом Зика. Главное преимущество этой техники в том, что она высокопроходная, проста и удобна в исполнении.

Демонстрировать эту процедуру будет Уильям Вэлиант, начинающий аспирант по инфекционным заболеваниям, в моей лаборатории. Начните с размораживания образцов сыворотки при комнатной температуре. После размораживания перенесите 100 микролитров каждого образца сыворотки в стерильную пробирку, нагрейте и активируйте в течение 30 минут при температуре 56 градусов Цельсия.

Затем сделайте 10-кратное серийное разведение образца сыворотки в диапазоне от одного к одному до одного к тысяче при холодном RPMI 10. Затем переложите по 10 микролитров каждого разведенного образца сыворотки в лунки стерильной 96-луночной пластины с V-образным дном. Затем разморозьте одну, две, три и четыре пропортерные вирусные частицы денге на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, обеспечив объем примерно 170 микролитров каждого RVP на образец сыворотки.

После размораживания сразу же перенесите трубки с РВП в лед. Затем пипетируйте 10 микролитров РВП в лунки, содержащие разведения образцов сыворотки, в контрольные лунки без сыворотки. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз от пяти до десяти раз.

Перенесите пластину с V-образным дном на 96 лунок в инкубатор и инкубируйте в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия, в присутствии 5% углекислого газа. Во время инкубации 96-луночной пластины с V-образным дном очистите поверхность шкафа биобезопасности 70% этанолом и включите ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут. Затем извлеките из инкубатора полностью сливающуюся колбу Т-75 с клетками К562.

Хорошо перемешайте клетки с помощью стерильной пятимиллиметровой пипетки и переложите пять миллилитров в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров. Далее извлеките из пробирки 10 микролитров клеток, смешайте с 10 микролитрами трипанового синего и загрузите в гемоцитометр. Посчитайте ячейки и подсчитайте общее количество ячеек.

После центрифугирования клеток при 12-кратном G в течение 10 минут сцеживают надосадочную жидкость и повторно суспендируют клетки в теплой РПМИ 10 в концентрации 80 тыс. клеток на 30 мкл среды. После извлечения 96-луночной пластины с V-образным дном из инкубатора перенесите по 30 микролитров клеток K562 на каждую стенку 96-луночной пластины с V-образным дном. И тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз от пяти до десяти раз.

Затем верните тарелку в инкубатор на один час. После инкубации центрифугируйте планшет при 12 сотнях G в течение пяти минут. После центрифугирования сцедите среду из лунок, перевернув пластину вверх дном в емкость, содержащую 10% отбеливателя.

Затем промойте ячейки в каждой стенке, повторно суспензив их в 125 микролитрах теплой RPMI 10 и центрифугируя, как и раньше. После сцеживания последней стирки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров теплого RPMI 10. Перемешайте с помощью пипетки и инкубируйте планшет в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии 5% углекислого газа.

Через два дня выньте тарелку из инкубатора и переложите в шкаф биобезопасности. С помощью многоканальной пипетки перемешайте содержимое каждой лунки и переложите на 96 лунку U-образную донную пластину. Промойте каждую лунку 96-луночной V-образной нижней пластины 100 микролитрами 1%-ного параформальдегида и PBS и перенесите оставшиеся ячейки и PBS в соответствующие лунки в 96-луночной U-образной нижней пластине.

Тщательно перемешайте с помощью многоканальной пипетки. Накройте пластину алюминиевой фольгой и дайте ей постоять в инкубаторе 30 минут для фиксации ячеек. Подготовьте проточный цитометр с помощью неокрашенных клеток K562 для калибровки настроек бокового и прямого рассеяния с использованием этилового канала для цветения GFP.

Затем приобретайте от 30 тысяч до 50 тысяч клеток из каждого образца. Используя программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, установите первый вентиль на основе зависимости площади прямого рассеяния от высоты прямого рассеяния, чтобы включить отдельные клетки и исключить автофлуоресцентные дубли из анализа. Рассчитайте средний процент GFP-положительных клеток для каждого состояния, а затем рассчитайте кратное усиление инфекции для каждого разведения сыворотки.

Увеличение сгиба графика по оси y по сравнению с разбавлением по оси x и выполнение статистического анализа с использованием ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки для множественных сравнений. Здесь приведены данные о репрезентативном животном, использующем частицы вируса денге. Процент GFP-положительных клеток для контрольного образца без сыворотки составил 0,253%Неразбавленный образец сыворотки был 2,58% GFP-положительным.

Доля GFP-положительных клеток достигала максимума в 12,8% при разведении сыворотки от одного до десяти, за этим следовало 0,735% при разведении от одного до ста и 0,022% при разведении от одного до тысячи. Антителозависимое усиление инфекции денге изучалось для четырех типов сывороток вируса денге. Данные показывают, что сыворотка, собранная через 16 недель после заражения, значительно усиливала инфицирование клеток K562 всеми типами сывороток вируса денге при разведении от одного до десяти.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 48 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что данные должны быть получены в течение одного-двух часов после завершения заключительного этапа фиксации продолжительностью 30 минут. Не забывайте, что работа с инфицированной сывороткой может быть чрезвычайно опасной, и при подготовке к этой процедуре всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как СИЗ и BSL2.