Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать технику введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио путем инъекции в почку рыбы. Введенные микрочастицы далее визуализируются в сосудистой сети с помощью простой техники прижизненной визуализации в жабрах рыб. Эта процедура может быть использована, например, для проведения повторных измерений рН крови рыб in vivo путем введения микрокапсулированных флуоресцентных зондов для измерения рН.

Для этого на первом этапе pH-чувствительный краситель SNARF-1, сопряженный с декстраном, инкапсулируется в полупроницаемую полиэлектролитную оболочку с помощью послойного подхода. Флуоресцентный краситель осаждается в пористые микроядра из карбоната кальция, а ядра покрываются несколькими слоями противоположно заряженных небиоразлагаемых полимеров и сверху покрываются биосовместимым полимером, содержащим полиэтиленгликоль. Далее ядра из карбоната кальция растворяют с получением целых микрокапсул, в которых заключен SNARF-1.

На втором этапе обезболивания и фиксации рыбы подготовленные микрокапсулы вводятся непосредственно в почку животного для доставки инкапсулированного красителя в кровеносную систему рыбы. Далее необходимо минимальное хирургическое вмешательство для удаления жаберного покрова и обнажения капилляров жабр рыб. Затем визуализация микрокапсул в крови и запись флуоресцентного спектра могут быть выполнены in vivo с помощью прижизненной микроскопии для контроля рН крови.

При правильно выполненной инъекции можно наблюдать флуоресцентные микрокапсулы в жабрах рыб сразу после процедуры. Спектр флуоресценции инкапсулированного зонда может быть зарегистрирован с помощью спектрометра, соединенного с флуоресцентным микроскопом. SNARF-1 имеет два пика излучения, и отношение между двумя длинами волн, соответствующими этим пикам, может быть использовано для измерения pH.

Предложенная методика позволяет доставлять флуоресцентные микрокапсулы в кровеносную систему рыб и дистанционно контролировать флуоресценцию в крови рыб in vivo. В случае физиологического исследования основным преимуществом данного метода являются повторные измерения показателей крови у мелких лабораторных животных, которые обычно трудно выполнить. Если используется светочувствительный флуоресцентный зонд, желательно проводить всю процедуру в помещении с уменьшенным уровнем освещенности.

Смешайте здесь два миллилитра раствора выбранного флуоресцентного красителя на полимерной основе, SNARF-1-декстрана, с 0,6 миллилитром одного молярного раствора хлорида кальция и 0,6 миллилитром одного молярного раствора карбоната натрия при быстром перемешивании. На этом этапе синтезируются пористые микроядра из карбоната кальция, заключающие в себе флуоресцентный краситель. После пяти, 10 секунд перемешивания переложите суспензию в микропробирки объемом два миллилитра и центрифугируйте в течение 15 секунд для гранулирования микроядер карбоната кальция.

Выбросьте надосадочную жидкость, промойте ядра примерно двумя миллилитрами деионизированной воды, и встряхните суспензию. Повторите процедуру центрифугирования и промывки три раза. Инкубируйте суспензию в течение одной минуты в ультразвуковой ванне, чтобы уменьшить агрегацию микроядер.

Ресуспендируйте микроядра карбоната кальция примерно в двух миллилитрах из четырех микрограммов на миллилитр раствора катионного полимера ПАУ, чтобы нанести первый полимерный слой на шаблоны. Подержите микроядра в растворе pH около пяти минут при постоянном встряхивании. После 15-секундного центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость с несвязанной ПАУ и трижды промойте микросердцевину водой путем многократного центрифугирования и промывки.

Повторите ту же процедуру с четырьмя миллиграммами на миллилитр раствором анионного полимера PSS, чтобы нанести второй полимерный слой на шаблоны. Непосредственно перед добавлением следующего слоя желательно провести минутную инкубацию в ультразвуковой ванне. Повторите последовательно осаждение катионных и анионных полимеров шесть раз для получения 12-слойной оболочки микрокапсулы.

Затем инкубируйте микроядра с оболочками в поли-L-лизине, привитом полиэтиленгликолем, в течение не менее двух часов. Затем один раз промойте покрытые микрожилы водой путем последовательного центрифугирования и повторного суспензирования. Наконец, растворите матрицы карбоната кальция в двух миллилитрах 0,1 молярного раствора ЭДТА, доведенного до pH примерно 7,1, чтобы получить полые микрокапсулы.

Выбросьте надосадочную жидкость после 45-секундного центрифугирования и повторите промывку ЭДТА дважды. Выбросьте надосадочную жидкость после 45-секундного центрифугирования и добавьте два миллилитра физиологического раствора. Повторите этапы промывки центрифугированием физиологическим раствором три раза.

Исследовать распределение по размерам и концентрацию полученных микрокапсул в гемоцитометре под флуоресцентным микроскопом. Используйте ImageJ или аналогичное программное обеспечение для анализа размера частиц. Храните полученный инкапсулированный зонд в темное время суток.

Для приготовления оптической системы необходимо поместить необходимый набор флуоресцентных фильтров в флуоресцентный микроскоп в соответствии с характеристиками применяемого флуоресцентного красителя, и включить люминесцентную лампу. Вытяните рычаг к окулярам. Подключите оптическое волокно с одного конца к спектрометру, а с другого конца к коллиматору.

С помощью переходников поиграйте коллиматором в фокусе трубки фотоаппарата или другого доступного порта флуоресцентного микроскопа. Для калибровки подготовленных микрокапсул поместите около пяти микролитров микрокапсульной суспензии на предметное стекло микроскопа, а каплю высушите в темном месте. Включите спектрометр.

Запустите программу управления спектрометром и подготовьте спектрометр к измерениям. Для калибровки спектральных характеристик микрокапсулированного SNARF-1 используют серию буферов с различным pH. Капните на высушенные микрокапсулы с SNARF-1 около 10 микролитров натриевого буфера и накройте покровным стеклом.

Поместите предметное стекло на предметное стекло на предметный столик микроскопа. Найдите микрокапсулы с увеличением около 400. Поверните рычажок микроскопа в сторону порта камеры.

Зарегистрируйте флуоресценцию с помощью спектрометра. Убедитесь, что спектральный сигнал находится далеко за пределами фонового уровня, и наблюдайте, что микрокапсулы не находятся в пузыре. Избегайте длительного освещения одних и тех же микрокапсул, так как СНАРФ-1 чувствителен к фотообесцвечиванию.

Поверните рычаг обратно к окулярам. Рассчитать отношение интенсивности флуоресценции инкапсулированного SNARF-1 на длине волны, соответствующей пикам излучения протонированного и депротонированного красителя. Постройте калибровочную кривую зависимости отношения от рН среды.

Соберите около 10 микролитров крови от усыпленных рыб. Определите его рН с помощью рН-метра с микроэлектродом. Затем капните кровь на предметное стекло с высушенными микрокапсулами и зарегистрируйте соотношение интенсивности флуоресценции, как описано для калибровочных буферов.

Поскольку необходимо учитывать влияние компонентов крови на считывание инкапсулированного SNARF-1, отрегулируйте линейный коэффициент калибровочной кривой, чтобы кривая совпала с измерениями в крови рыб. Чтобы подготовить иглу к инъекции, освободите стальную иглу от кончика инсулинового шприца, удалив пластик острым ланцетом. Введите иглу наполовину в стеклянный микрокапилляр.

Быстро и аккуратно припаяйте его газовой горелкой. Подсоедините стеклянный микрокапилляр к микроинъектору и трижды промойте его стерильной водой. Следите за тем, чтобы жидкость протекала через иглу.

Наполните систему водой. Убедитесь, что в системе нет пузырей. В день проведения эксперимента принимают приготовленную суспензию микрокапсул в стерильном физрастворе, содержащем от полутора до шести миллионов микрокапсул на микролитр.

Снова подсунзрируйте его у ультразвуковой ванны на одну минуту. Во время следующей инъекции периодически встряхивайте флакон для ресуспендирования микрокапсул и предотвращения их агрегации. С помощью блесны достаньте рыбу из анестетика и аккуратно положите ее на влажную губку в боковом положении головой влево, если вы правша, или вправо, если вы левша.

Непосредственно перед впрыском втяните один-два миллиметра воздуха в стеклянный капилляр, соединенный микроинжектором. Затем загрузите в него примерно два микролитра диспергированных микрокапсул. Аккуратно стабилизируйте тело рыбки на губке своей недоминирующей рукой.

Найдите боковую линию рыбы. Поместите иглу на один миллилитр ниже средней точки брюшного сегмента боковой линии. Затем соскабливающим движением отодвинуть рыбью чешую в сторону, и сделать прокол.

Введите иглу в корпус под углом 45 градусов к поверхности стола. Проталкивайте иглу к позвоночнику до тех пор, пока она не упрется в позвоночник. Затем медленно выпустите около одного микролитра микрокапсульной суспензии в почку и медленно извлеките иглу.

Промойте рыбу с головы до хвоста струей воды, чтобы удалить разлитые микрокапсулы в месте инъекции. С помощью ножниц для вскрытия снимите жаберную крышку с головы рыбы и обнажите жабры рыбы. Промойте жабры водой.

С помощью ложки переложите рыбку на предметное стекло микроскопа, и поместите ее на столик флуоресцентного микроскопа. Выполняя следующие процедуры, следите за тем, чтобы жабры рыбок не пересыхали. Для этого нужно периодически смачивать их водой с помощью пастеровской пипетки.

Затемните помещение и с помощью малого увеличения осмотрите жабры, чтобы найти флуоресцентные микрокапсулы. Когда вы найдете его, переключите объектив на большую величину и расположите его в центре поля зрения. Поверните рычаг к порту с подключенным спектрометром.

Запишите спектральный сигнал. Поверните рычаг обратно к окулярам. Повторите измерения для разных микрокапсул несколько раз.

Пересадите рыбок в аквариум с правильной аэрацией для восстановления. Процедура измерения может быть повторена для одного индивидуума несколько раз с применением повторной анестезии или другого метода фиксации. На рисунке представлен репрезентативный пример in vivo измерений крови рыбок данио и гиперкапнии с помощью инкапсулированного флуоресцентного красителя SNARF-1.

В контрольных условиях рН крови остается стабильным в течение четырех часов после введения микрокапсул, в то время как пятиминутное воздействие при повышенном углекислом газе вызывает закисление крови рыб. Во время проведения процедуры важно свести к минимуму стресс животного, вызванный обращением и хирургическим вмешательством. При некоторой практике и инъекция, и регистрация сигнала в среднем занимают около двух, трех минут, поэтому этот протокол позволяет завершить манипуляции до того, как рыба очнется от мягкого наркоза.

Во время процедуры следите за тем, чтобы жабры рыбок всегда были увлажнены. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять простую и эффективную имплантацию микрочастиц в кровеносную систему мелкой рыбки. Как было продемонстрировано, эта методика очень удобна для повторных in vivo записей рН крови у взрослых рыбок данио с помощью микрокапсул, наполненных флуоресцентным зондом.