Microstructured устройства для оптимизированного микроинъекции и изображений личинок данио рерио

Общая цель данной методики заключается в том, чтобы сделать микроинъекцию личинок рыбки зербра более простой и точной. Этот метод помогает исследователям, использующим модельные системы данио-рерио, иммобилизовать личинок данио-рерио в определенных ориентациях в больших массивах. Этот метод обеспечивает более легкий доступ к определенным тканям для микроинъекций и визуализации, а также очень эффективен, когда требуется большое количество личинок для таких применений, как инфекции или модели рака ксенотрансплантата.

Мои стратегии изготовления в моделях рыбок данио в значительной степени дополняют друг друга. Один из них рукотворный и простой. Другой – живой и сложный.

Оба имеют одинаковую шкалу размеров. Они оба прозрачны. И то, и другое позволяет проводить наблюдения с разрешением одной клетки.

Как вы показываете здесь, их можно легко комбинировать, и они могут быть применены для изучения практически любого серьезного заболевания. После приготовления блока PDMS в чашке Петри, покрытой тонкой пленкой Е-3, согласно текстовому протоколу, с помощью переносной пипетки перенести необходимое количество эмбрионов на поверхность блока PDMS. С помощью петли для волос или аналогичного инструмента протолкните эмбрионы в углубления микроструктуры, особенно для дорсальной и вентральной ориентации.

При загрузке личинок в углубления важно, чтобы блок PDMS был покрыт достаточным количеством воды, чтобы с ним можно было легко работать. Также важно проталкивать их в углубления, чтобы они оставались на месте во время впрыска. Чтобы сориентировать рыбок данио по предварительно подготовленным в соответствии с текстовым протоколом каналам для переноса Е-3 из структурированного блока PDMS, используйте передаточную пипетку.

Уровень Е-3 должен опускаться ниже края блока, но все равно присутствовать в водоеме и каналах, а на ПДМС остается тонкий слой. С помощью пересадочной пипетки перенесите в резервуар 10 обезболиваемых эмбрионов, стараясь не переполнить края. Используя петлю для волос, манипулируйте каждым эмбрионом в головке воронки, сначала на входе в соответствующий канал, следя за тем, чтобы эмбрион имел соответствующую ориентацию при входе в канал.

Затем с помощью петли для волос проведите каждый эмбрион вниз по каналу, пока он не достигнет ориентирующих микроэлементов в стенках канала, которые удерживают его на месте. После приготовления игл для микроинъекций и раствора для микроинъекций с помощью тонко конического наконечника пипетки загрузите в иглу пять микролитров раствора. Установите иглу в микроманипулятор, установленный на магнитной стойке, и подключите его к микроинъектору насоса PICO.

Затем с помощью щипцов сломайте кончик иглы под углом 45 градусов, зажав конусообразный кончик. Отрегулируйте размер кома впрыска до одного нанолитра, отрегулировав время впрыска на контроллере насоса PIKO. Отрегулируйте угол наклона иглы для микроинъекций на контроллере микроманипуляции, начиная с 45 градусов с иглой, параллельной длине эмбриона.

Более крутой угол может быть использован для минимизации бокового перемещения эмбриона во время микроинъекции. Управляя чашкой Петри левой рукой, а необходимым микроманипулятором – правой, подвести иглу как можно ближе к предполагаемому месту микроинъекции, например, к глазному пузырьку. С помощью контроллера микроманипуляций введите иглу в целевую ткань и с помощью ножного переключателя насоса PICO введите заданный объем.

Если ткань сопротивляется проникновению, аккуратно постучите по ручке контроллера микроманипуляции. Чтобы высвободить эмбрионы, используйте передаточную пипетку, чтобы прокачать Е-3 по поверхности сверху вниз или вращая чашку таким образом, чтобы эмбрионы высвобождались в окружающую Е-3. Перенесите эмбрионы в чашку для восстановления E-3 без MS-222.

Для скрининга эмбрионов с помощью устройства PDMS в лунках шестилуночного планшета используйте пипетку объемом 1000 микролитров или транспортную пипетку с узким наконечником для заполнения устройства путем подачи E-3 через порт. Используйте E-3 и MS-222 для заполнения лунки до тех пор, пока устройство не будет закрыто. Затем с помощью передаточной пипетки доставьте четыре ранее введенных эмбриона в каждую лунку.

С помощью петли для волос или аналогичного инструмента расположите эмбрионы у входов в каналы визуализации в нужной ориентации и частично протолкните их в устройство. Это поможет втянуть их в устройство равномерно. С помощью пипетки объемом 1 000 микролитров или транспортной пипетки проведите E-3 через устройство от порта до тех пор, пока эмбрионы не будут втянуты в каналы в правильной ориентации для визуализации.

Перенесите луночный планшет в инвертированный флуоресцентный микроскоп. Чтобы получить изображение эмбрионов, отрегулируйте увеличение, выбрав подходящий объектив, например, 10-кратный для визуализации миграции рыбок данио-рерио. Отрегулируйте интенсивность источника света и время экспозиции для каждого канала, чтобы каждый сигнал был четким, но не насыщенным.

Наконец, захватите изображения для каждого флуоресцентного и передаваемого канала. С помощью микроструктурированного канального устройства для стабилизации эмбрионов в боковой ориентации была проверена способность нейтрофилов реагировать на стандартные хемоаттрактанты fMLP и LTB4, микроинъецируемые в глазные везикулы, у эмбрионов рыбок данио-рерио через два дня после оплодотворения. Чтобы визуализировать рекрутирование нейтрофилов, были прослежены инъекции высокомолекулярного родамина декстрана и выполнены в трансгенных эмбрионах с зелеными флуоресцентными нейтрофилами.

Неинъекционные эмбрионы и эмбрионы, которым вводили только родамин, использовали в качестве отрицательного контроля. После микроинъекции эмбрионы были перенесены в устройство для визуализации и визуализированы с помощью флуоресцентного микроскопа EVOS через 30 минут и пять часов после инъекции. Как и ожидалось, небольшое количество флуоресцентных нейтрофилов было рекрутировано в фиктивно инъецируемый глазный везикул в ранний момент времени, вероятно, из-за поврежденного опосредованного рекрутмента.

Интересно, что в ходе эксперимента наблюдалось накопление индикатора родамина декстрана в отолитах. Для обоих хемоаттрактантов нейтрофилы были рекрутированы в большем количестве, особенно в ответ на LTB4. После освоения эта техника может значительно повысить скорость и точность микроинъекций рыбок данио

Разработка этой методики была вызвана специфическими проблемами в нашей лаборатории. Мы усовершенствовали этот подход в соответствии с потребностями наших проектов по грибковым инфекциям и опухолевым ксенотрансплантатам на моделях рыбок данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микроструктурированные поверхностные матрицы для микроинъекций рыбок данио и для расширенной визуализации в реальном времени.