Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования
7 апреля 2016 г.
Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ развития органа у эмбрионов данио с помощью флуоресценции рассекает микроскопа, способные выполнять оптические секционирования и простые стратегии переналадки для коррекции фокусного и плоскостную дрейф.
Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении возможности проведения таймлапс-анализа различных процессов развития с использованием флуоресцентного стереомикроскопа и простых стратегий повторного совмещения после дрейфа объекта в любом направлении. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, так как он дает возможность прямого наблюдения за развитием тканей и органов в живых эмбрионах на протяжении нескольких часов. Основным преимуществом данного метода является то, что он представляет собой доступную и простую в использовании альтернативу более сложным методам, обычно применяемым для таймлапс-записи развития тканей и органов, таким как лазерное сканирование или световая микроскопия.
Хотя данный метод позволяет получить представление о пространственных и временных изменениях, происходящих в ходе развития эмбрионов и личинок рыбы-метлы, его также можно применять для изучения ранних процессов развития других модельных организмов. Кроме того, он подходит для наблюдения за динамическими процессами у взрослых особей, такими как заживление и регенерация корней. Для подготовки отберите высокопродуктивных взрослых рыб из трансгенной линии, экспрессирующей GFP.
Днем накануне микроинъекций растений поместите пять пар самцов и самок репродуктивных рыб в пять контейнеров для разведения. В контейнерах держите самца и самку разделенными с помощью съемного сита в течение ночи. На следующее утро, сразу после включения света, поместите самца и самку вместе над ситом, которое предотвратит поедание ими икры.
Теперь наблюдайте за рыбами во время нереста. Как только пара отложит около 50 икринок, отделите их. Затем с помощью пипетки Пастера перенесите икринки в чашку Петри с водой для эмбрионов для первого раунда инъекций.
Повторите этот процесс для каждой спарившейся пары. Если потребуются дополнительные яйца, одни и те же пары можно объединять и разделять несколько раз. Предварительная подготовка чашек и игл для микроинъекций проводится стандартным образом.
Подробную информацию можно найти в текстовом протоколе. Начните с загрузки подготовленной инъекционной иглы. С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглу двумя микролитрами рабочего раствора MO, после чего закрепите иглу в микроманипуляторе.
Затем можно открыть кончик иглы. Рассматривая его под диссекционным микроскопом, используйте пинцет, чтобы разжать конец, или прижмите кончик к твердой поверхности. После этого откалибруйте объем инъекции, вводя раствор MO в каплю минерального масла на предметном стекле с градуировочной сеткой.
Отрегулируйте инъектор так, чтобы размер капель составлял 75 микрон, что соответствует примерно 200 пиколитрам раствора. Затем подготовьте эмбрионы для инъекции. Расположите эмбрионы на стадии примерно 21 клетки вдоль желобка чашки для микроинъекций так, чтобы вегетативный полюс был ориентирован в сторону подхода иглы для микроинъекций, которая располагается под углом 45 градусов к желобку.
Теперь проведите инъекцию эмбрионов. Иглой проколите хорион и желточный мешок, затем введите раствор Morpholino в желток. Этот метод подходит для эмбрионов на стадии одной или двух клеток.
После инъекции всех эмбрионов соберите их с помощью пастеровской пипетки с широким отверстием. Перенесите инъекционированные эмбрионы в чашки Петри, заполненные водой для эмбрионов, и инкубируйте их при температуре 28.5 °C. Позже, во второй половине дня, удалите погибшие эмбрионы с помощью сифона и замените воду для эмбрионов.
На следующее утро, после того как эмбрионы прошли стадию гаструляции, подавите их меланизацию, заменив воду на воду для эмбрионов, содержащую небольшое количество PTU. Будьте осторожны: PTU нарушит правильное развитие до стадии гаструляции. Позже, на нужной стадии развития, проведите дехорионизацию эмбрионов с помощью острого пинцета.
Используя микроскоп, захватите хорион одним пинцетом, затем попытайтесь захватить противоположную сторону хориона вторым пинцетом. Осторожно раздвиньте пинцеты в разные стороны, не повреждая эмбрион. После этого анестезируйте эмбрионы с помощью Tricaine и приступайте к помещению эмбрионов и агарозы на релокационную сетку с ячейками 15 микрон, помещенную в микрочашку с покровным стеклом на дне.
Затем распределите по 1 мл расплавленного агарозы в реакционные пробирки объемом 1,5 мл. Поместите пробирки в термоблоки, установленные на 36 °C, и дождитесь их охлаждения. Затем с помощью пипетки с широким наконечником перенесите эмбрион в микродиск.
Слейте излишки воды с эмбрионами и залейте эмбрион агарозой. Пока агароза еще жидкая, с помощью двух маленьких наконечников для пипеток определите положение эмбрионов. Расположите интересующую структуру, в данном случае пронефрос, как можно ближе к стеклянному дну и в непосредственной близости от сетки.
Сетка не должна перекрывать интересующую структуру. Рекомендуется поместить до четырех эмбрионов в разные микрочашки и планировать визуализацию наилучшего из них. Правильное встраивание требует определенной практики.
Пока агароза остается жидкой, необходимо расположить эмбрион в нужном положении. Убедитесь, что пронефрос находится близко к стеклянному дну и на подходящем расстоянии от сетки для перемещения. Регулярно проверяйте состояние агарозы.
Когда гель станет достаточно твердым, чтобы удерживать эмбрионы, дайте ему застыть еще две-три минуты. Затем залейте закрепленный эмбрион водой для эмбрионов, содержащей следовые количества PTU и трикаина. Слейте или откачайте излишки воды для эмбрионов и плотно закройте крышку, чтобы предотвратить испарение.
В результате не должно остаться пузырьков воздуха. Теперь можно проводить визуализацию эмбриона, расположив стеклянное дно напротив объектива. При использовании данного препарата для получения серии изображений (таймлапса), например, путем периодического выполнения Z-стеков в течение нескольких часов, необходимо корректировать дрейф фокуса.
По возможности используйте стратегию автоматической фокусировки. Включите опцию автофокусировки в панели управления программного обеспечения. Для референсного канала выберите канал transmitted light bright field (светлое поле при проходящем свете), чтобы минимизировать фототоксичность.
Также крайне важно выбрать достаточно широкий диапазон поиска по образцу для корректной работы автофокуса. Перед началом съемки совместите определенную точку нанесенной сетки с интересующей структурой в перекрестии программного обеспечения, затем сохраните это положение с помощью скриншота. Затем, непосредственно перед окончанием каждого временного интервала съемки, сверьтесь со скриншотом и при необходимости заново отрегулируйте положение предметного столика и фокус, если автофокус не используется.
Представленный метод был использован для анализа развития почек у эмбрионов трансгенной линии zebrafish с морфиновым нокдауном WT1A. На ранних стадиях нефрогенеза в данной линии наблюдалась зеленая флуоресценция в промежуточной мезодерме, где возникают предшественники почек, а затем, в ходе развития, в формирующихся канальцах и зачатках нефронов. Таймлапс-визуализация выявила нормальный нефрогенез в контрольных эмбрионах, в которые вводили морфолино.
Через 20 часов после оплодотворения стали видны развивающиеся пронефрические канальцы. На их передних концах можно было обнаружить сферическое скопление клеток, представляющее собой формирующиеся зачатки нефронов. В течение следующих нескольких часов канальцы и зачатки нефронов росли, и зачатки начали сливаться по срединной линии.
Напротив, нефрогенез у мутантов был серьезно нарушен. Хотя через 20 часов после оплодотворения были видны GFP-положительные трубчатые структуры, они были диффузными и недоразвитыми. Таймлапс-визуализация показала, что зачатки нефронов так и не сформировались, а значительное количество флуоресцентных клеток, расположенных за пределами развивающихся пронефронов, мигрировали в вентральном направлении, покидая пронефрическую область.
При выполнении данного протокола важно помнить, что отсутствие дополнительного оборудования, такого как системы контроля температуры или столы с защитой от испарения, требует регулярной проверки на предмет отклонений и проведения соответствующих корректировок. После выполнения данной процедуры визуализированные эмбрионы можно подвергнуть обработке другими методами, такими как иммуногистохимия, ин ситу гибридизация или ПЦР в реальном времени, чтобы идентифицировать специфические компоненты клеток, тканей или оценить экспрессию генов.
Обзор
Данный метод позволяет проводить таймлапс-анализ развития органов эмбрионов zebrafish с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. Он обеспечивает возможность прямого наблюдения за развитием тканей и органов в течение нескольких часов, что дает ценные сведения в области биологии развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития
- Эмбриология zebrafish
- Методы микроскопии
Теоретическая часть
- Таймлапс-визуализация имеет решающее значение для изучения процессов развития.
- Традиционные методы могут быть сложными и дорогостоящими.
- Данный метод представляет собой более простую и доступную альтернативу.
- Он может быть применен к различным модельным организмам.
Цель исследования
- Для облегчения наблюдения за развитием органов в живых эмбрионах.
- Для предоставления простого в использовании и экономически выгодного метода.
- Для того чтобы дать исследователям возможность изучать динамические процессы развития.
Используемые методы
- Подготовка взрослых особей zebrafish для разведения.
- Микроинъекция растворов морфолино в эмбрионы.
- Помещение эмбрионов в агарозу для визуализации.
- Таймлапс-визуализация с использованием флуоресцентного dissecting-микроскопа.
Основные результаты
- Успешное наблюдение за развитием органов в эмбрионах zebrafish.
- Продемонстрирована эффективность метода для таймлапс-визуализации.
- Получены данные о пространственных и временных изменениях в процессе развития.
- Показана применимость метода к другим процессам развития и организмам.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для исследований в области биологии развития.
- Он упрощает процесс наблюдения за живыми эмбрионами в динамике.
- Он открывает новые возможности для изучения различных феноменов развития.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильных отраслей
Данный метод представляет собой доступный подход к таймлапс-визуализации органогенеза в эмбрионах zebrafish, позволяющий напрямую наблюдать за процессами развития без необходимости использования сложной или дорогостоящей инфраструктуры микроскопии. Поддерживая продольное наблюдение за динамикой тканей в модели позвоночных, этот метод облегчает валидацию мишеней на ранних этапах и снижение механистических рисков в процессах поиска новых лекарственных средств. Данная техника является экономически эффективной альтернативой для получения количественных, воспроизводимых данных о морфогенетических событиях, имеющих значение для моделирования заболеваний и фенотипического скрининга.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию генов в развитии почек путем визуализации пространственных и временных изменений нефрогенеза при нокдауне wt1a.
- Практическая ценность: обеспечивает проверку гипотез посредством прямой визуализации формирования пронефротических трубочек и слияния зачатков нефронов в живых эмбрионах.
- Прогностическая ценность: облегчает оценку степени выраженности фенотипа в моделях морфантов, что помогает оценить достоверность мишеней для путей развития почечных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные z-стеков и таймлапс-записей флуоресцентно меченных структур почек для сравнительного анализа контрольных условий и условий с внесенными возмущениями.
- Операционная ценность: Использование флуоресцентного диссекционного микроскопа с автофокусом и сетками релокации позволяет минимизировать дрейф, повышая воспроизводимость между сеансами визуализации.
- Готовность анализа: Обеспечивает получение стандартизированных результатов визуализации, которые могут быть использованы для установления базовых фенотипов при скрининге соединений или изучении генетических модификаторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет наблюдать за консервативными процессами развития у zebrafish — системы, имеющей значение для изучения заболеваний при моделировании расстройств почек человека.
- Механистическое снижение рисков: позволяет отслеживать дефекты миграции клеток и морфогенеза канальцев, что дает представление о побочных или специфических для конкретного пути эффектах генетических пертурбаций.
- Доклиническое согласование: поддерживает переход от этапа открытия к доклинической валидации путем установления дозо- или времязависимых фенотипических показателей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о мишенях до идентификации соединений-лидеров, что особенно актуально для почечных путей, где динамическая визуализация тканей позволяет определить механизм действия и фенотипический результат.
- Открывательная биология: способствует функциональной валидации мишеней, таких как wt1a, обеспечивая наблюдение в режиме реального времени за последующими последствиями развития в живой системе.
- Скрининг: позволяет получать воспроизводимые результаты на основе флуоресценции, подходящие для оценки влияния соединений на морфогенез почек в контексте позвоночных.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение длины канальцев, формирования зачатков и клеточной локализации с течением времени, что позволяет проводить объективное сравнение между экспериментальными группами.
- Трансляционные исследования: связывает фенотипы раннего развития с органной дисфункцией на более поздних стадиях, поддерживая оценку ренальной токсичности или восстановления на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой масштабируемую возможность визуализации, которую можно применять к различным моделям развития и органным системам с минимальной перенастройкой.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней, связывая генетическое воздействие с наблюдаемыми дефектами развития в физиологическом контексте.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет аппаратной коррекции дрейфа (автофокус, сетки релокации) и стандартизированной подготовки эмбрионов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), обеспечивая раннее визуальное подтверждение модуляции сигнального пути в анализе на целом организме.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе степени выраженности и специфичности фенотипов развития, наблюдаемых in vivo.
Особенности реализации
- Для успешного применения требуются навыки содержания Danio rerio, микроинъекций и стадирования эмбрионов.
- Метод зависит от наличия флуоресцентного диссекционного микроскопа с возможностью Z-стекирования и программного обеспечения, поддерживающего автофокусировку и репозиционирование предметного столика.
- Необходима стандартизация процесса вшивания в агарозу и ориентации эмбрионов для обеспечения стабильного качества изображений при работе разных пользователей и в разных сессиях.
- Адаптация метода для других органов или моделей может потребовать изменения трансгенных репортеров, времени инъекций или стадий развития.
- Практические ограничения включают более низкую пропускную способность по сравнению с автоматизированными системами, а также необходимость ручного контроля дрейфа при отсутствии автофокусировки.
