Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ развития органа у эмбрионов данио с помощью флуоресценции рассекает микроскопа, способные выполнять оптические секционирования и простые стратегии переналадки для коррекции фокусного и плоскостную дрейф.

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить покадровый анализ различных процессов развития с использованием флуоресцентного препарирующего микроскопа с простыми стратегиями перестройки после дрейфа в любом направлении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, поскольку он позволяет непосредственно наблюдать за развитием тканей и органов у живых эмбрионов в течение нескольких часов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он является доступной и простой в использовании альтернативой более сложным методам, обычно используемым для покадровой съемки развивающихся тканей и органов, таким как лазерное сканирование или световая микроскопия.

Хотя этот метод может дать представление о пространственных и временных изменениях, происходящих во время развития эмбриона и личинок рыбы-подметателя, он также может быть применен для исследования ранних процессов развития и других модельных организмов. Кроме того, он подходит для наблюдения за динамическими процессами во взрослых организмах, такими как заживление и регенерация корней. В процессе подготовки определите высокорепродуктивных взрослых рыб из трансгенной линии экспрессии GFP.

Во второй половине дня перед микроинъекцией растений установите пять пар самцов и самок репродуктивных рыб в пять контейнеров для разведения. В контейнерах держите самца и самку отдельно от съемного сита на ночь. На следующее утро, сразу после того, как зажжется свет, посадите самца и самку вместе над решетом, что не даст им съесть свои яйца.

Теперь понаблюдайте за рыбами во время их нереста. Как только пара произведет около 50 икринок, отделите их. Затем перенесите яйцеклетки с помощью пастеровской пипетки в чашку Петри, наполненную водой для эмбрионов, для первого раунда инъекций.

Повторите этот процесс для каждой спаренной пары. Если нужны дополнительные яйца, такие же брачные пары можно свести вместе и разлучить несколько раз. Для микроинъекции предварительная подготовка посуды и инъекционных игл производится достаточно стандартным образом.

Подробности можно найти в текстовом протоколе. Начните с загрузки подготовленной инъекционной иглы. С помощью наконечника микрозагрузчика засыпьте иглу двумя микролитрами рабочего раствора МО, а затем прикрепите иглу в микроманипулятор.

Затем кончик иглы можно открыть. Рассматривая его с помощью диссекционного микроскопа, используйте пинцет, чтобы зажать конец, или прижмите кончик к жесткой поверхности. Затем откалибруйте объем впрыска, впрыскивая раствор МО в каплю минерального масла на градусной сетке.

Отрегулируйте инъекцию так, чтобы сделать капли по 75 мкм, что будет соответствовать примерно 200 пиколитрам раствора. Далее подготовьте эмбрионы к введению инъекций. Расположите примерно 21 эмбрион клеточной стадии вдоль канавки чашки для микроинъекций так, чтобы вегетативный полюс был направлен к подходу иглы для микроинъекции, который находится под углом 45 градусов от канавки.

Теперь введите эмбрионы. Иглой продырявите хорион и желток, затем введите в желток загруженный раствор Морфолино. Это работает для эмбрионов на стадии одной или двух клеток.

После введения всех эмбрионов используйте широкий канал Пастера для их сбора. Перенесите введенные эмбрионы в чашки Петри, наполненные водой для эмбрионов, и инкубируйте их при температуре 28,5 градусов Цельсия. Позже во второй половине дня откачайте мертвые эмбрионы и замените зародышевую воду.

На следующее утро, после того как эмбрионы прошли через гаструляцию, подавите их меланизацию, заменив их воду водой для эмбрионов, содержащей следовое количество ПТУ. Будьте осторожны, ПТУ нарушит правильное развитие до начала гаструляции. Позже, на нужной стадии развития, дехорионировать эмбрионы острым пинцетом.

С помощью микроскопа захватите хорион одним пинцетом, а вторую пару пинцетов попытайтесь захватить с другой стороны хориона. Затем осторожно раздвиньте пинцет, не нарушая эмбрион. Затем обезболите эмбрионы трикаином и приступайте к встраиванию эмбрионов и агарозы в сетку для перемещения 15 микрон, помещенную в микрочашку с покровным стеклянным дном.

Затем загрузите одну миллилилитровую аликвоту расплавленной агарозы в реакционные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Поместите трубки в нагревательные блоки, установленные на 36 градусов Цельсия, и подождите, пока они остынут. Затем с помощью пипетки с широким отверстием перенесите эмбрион в микрочашку.

Откачайте из зародыша лишнюю воду и обложите зародыш агарозой. Пока агароза еще жидкая, используйте два небольших наконечника для пипетки, чтобы сориентировать эмбрионы. Расположите интересующую конструкцию, в данном случае пронефрос, как можно ближе к стеклянному дну, и в непосредственной близости от сетки.

Сетка не должна накладываться на интересующую структуру. Выгодно встраивать до четырех эмбрионов в разные микрочашки, и планировать изображение лучшего из них. Правильное встраивание требует некоторой практики.

Пока агароза еще находится в жидком состоянии, эмбрион должен быть ориентирован в нужном положении. Если это пронефрос близко к стеклянному дну, так и на подходящем расстоянии к передислокации сетки. Регулярно проверяйте агарозу.

Как только эмбрионы станут достаточно твердыми, дайте им отстояться еще две-три минуты. Затем наложите на внедренный эмбрион зародышевую воду, содержащую следовые количества ПТУ и трикаина. Сцедите или откачайте лишнюю воду из зародыша и закройте крышкой, чтобы предотвратить испарение.

В результате не должно быть пузырьков воздуха. Теперь эмбрион можно визуализировать, когда стеклянное дно обращено к линзе объектива. Используя препарат для получения lapse-изображений, например, делая снимки Z-стека периодически в течение нескольких часов, необходимо скорректировать смещение фокуса.

Если есть возможность, примените стратегию автофокусировки. Включите опцию автофокусировки в программном управлении. В качестве опорного канала выберите канал яркого поля проходящего света, чтобы свести к минимуму фототоксичность.

Также важно выбрать достаточно большой диапазон поиска, зависящий от образца, чтобы автофокусировка работала правильно. Перед сбором изображений расположите определенную точку впечатанной сетки рядом с интересующей структурой в перекрестии программного обеспечения, а затем сохраните эту позицию с помощью скриншота. Затем, непосредственно перед окончанием каждого временного интервала изображения, обратитесь к снимку экрана и измените положение рабочей области и фокуса, если автофокусировка не используется.

Представленный метод был использован для анализа развития почек у морфированных эмбрионов WT1A трансгенной линии рыб данио. Во время раннего нефрогенного периода эта линия выбрала зеленую флуоресценцию в промежуточной мезодерме, где возникают предшественники почек, а позже во время развития в формирующихся канальцах и зачатках нефрона. Покадровая визуализация показала нормальный нефрогенез у эмбрионов контрольной группы, введенных Morpholino.

Через 20 часов после оплодотворения были видны развивающиеся пронефрические канальцы. На их передних концах можно было обнаружить сферическое скопление клеток, представляющих формирующиеся зачатки нефрона. В течение следующих часов трубочки и зачатки нефрона выросли, а примордии начали срастаться по средней линии.

Напротив, у мутантов нефрогенез был серьезно нарушен. Несмотря на то, что через 20 часов после оплодотворения были видны GFP-положительные трубчатые структуры, они были диффундированы и недоразвиты. Покадровая съемка показала, что нефронные приморгии так и не образовались, и поразительное количество флуоресцентных клеток, расположенных за пределами развивающихся пронефронов, мигрировало вентрально, покидая пронефрическое поле.

При использовании этого протокола важно помнить, что отсутствие дополнительного оборудования, такого как столы для контроля температуры или защиты от испарения, требует регулярных проверок на наличие смещений и повторных регулировок. После этой процедуры эмбрионы могут быть обработаны для выполнения других методов, таких как иммуногистохимия, инцетрогипертизация или ПЦР в реальном времени, чтобы идентифицировать конкретные компоненты клеток, тканей или оценить экспрессию генов.