Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ядерной механики. Например, какая сила требуется для деформации ядра в клетке? Каков вклад клеточных и ядерных компонентов в ядерную стойкость к деформации?

Или зависит ли ядерное взаимодействие с клеточными структурами в зависимости от типа клетки? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет прикладывать зондирующую силу для деформации интегрирующего нуклеоцитоскелета в живой адгезивной клетке. Хотя этот метод был использован для получения представления о ядерных механических свойствах в клетках NIH-3T3, он также может быть применен к любому типу адгезивных клеток, например, для исследования ядерных механических свойств в прогериальных клетках Хатчинсона-Гилфорда.

Чтобы начать эту процедуру, покройте 35-миллиметровую стеклянную посуду с дном 5 микрограммами фибронектина на миллилитр. Затем культивировали клетки фибробластов 3T3 NIH в DMEM с добавлением 10% донорской сыворотки крупного рогатого скота и 1% пенициллин-стрептомицина на покрытой чашке при температуре 37 градусов Цельсия до желаемого слияния. Непосредственно перед экспериментом дважды промойте клетки PBS, а затем однократно промойте полной питательной средой.

После этого добавьте три миллилитра полной среды для роста в стеклянную посуду. В этой процедуре включите микроинжектор. С помощью пипетки иммерсионного масла нанесите каплю иммерсионного масла на линзу объектива.

Затем плотно зажмите тарелку в держателе для тарелки и загрузите держатель для тарелки на сцену. Обратите внимание, что в клетках следует поддерживать температуру 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на протяжении всего эксперимента. Затем отрегулируйте высоту объектива, чтобы сфокусировать клетки.

Переместите предметный столик микроскопа, чтобы найти интересующую вас клетку. С помощью микроманипулятора переместите держатель пипетки в самое верхнее положение. Затем загрузите микропипетку с наконечником диаметром 0,5 микрометра в держатель пипетки.

Затем поднимите фокальную плоскость объектива над плоскостью А и верхнюю часть ячейки до плоскости В, регулируя тонкий регулятор. Далее установите микроманипулятор в положение грубого управления. Медленно опустите микропипетку в плоскость В, наблюдая за силуэтом микропипетки, пока микропипетка полностью не окажется в фокусе.

Как только наконечник микропипетки окажется в фокусе, установите микроманипулятор в режим точного управления. Затем опустите объектив до экваториальной плоскости клетки и опустите микропипетку примерно на 15 микрометров выше этого. Установите компенсационное давление на микроинжекторе на нужное давление.

Подождите несколько секунд, пока давление стабилизируется. Важно проверить, не сломан ли или не забит ли наконечник пипетки, в противном случае измерение силы будет неточным. Убедитесь, что микропипетка не забита, используя настройку очистки на панели микроманипулятора, и убедитесь, что пузырьки воздуха выходят из наконечника микропипетки.

Затем вставьте наконечник микропипетки в ячейку до тех пор, пока он слегка не коснется поверхности ядра. Создайте уплотнение между наконечником микропипетки и ядерной мембраной, отсоединив трубку подачи давления от системы микровпрыска, тем самым открыв конец микропипетки для атмосферы. На этом этапе создается отрицательное давление, равное компенсационному давлению на поверхность ядра.

Затем откройте программу для сбора изображений. Настройте захват AVI для видео или сбор ND для изображений в программном обеспечении для сбора изображений. Затем переключитесь на соответствующий канал флуоресцентной визуализации и начните визуализацию.

Отодвиньте кончик микропипетки от тела клетки до тех пор, пока ядро не отделится от микропипетки. На этом рисунке показано воздействие ядра фибробласта мыши 3T3 NIH. Когда кончик микропипетки смещается вправо, ядро деформируется и в конечном итоге отделяется от кончика микропипетки.

Видно, что деформация длины ядра увеличивается с увеличением силы всасывания. Передний край ядра образует ядерный выступ, а задний край смещен от исходного положения. Длина выступа намного больше, чем смещение заднего края, что предполагает тесную интеграцию между ядром и окружающей цитоплазмой.

Временные шкалы являются короткими для расслабления ядерного переднего края и ядерного заднего края. С помощью прямого силового зонда определяли вклад внутриядерных и цитоскелетных структур в устойчивость ядра к деформации. Флуоресцентные изображения показали наложение ядра до и после в указанном состоянии.

Несмотря на то, что не было обнаружено существенных различий в деформации или трансляции ядер после разрушения F-актина или микротрубочек, снижение экспрессии ментена через нокдаун на основе миРНК привело к значительно большей ядерной трансляции и деформации. Это говорит о том, что промежуточные филаменты ментена в фибробластах являются основным цитоскелетным элементом, который помогал ядру сопротивляться местной силе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять контролируемую и известную силу к ядру в живой адгезивной клетке.