Антимикробной характеристика современных материалов для приложений биоинженерии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области материаловедения, такие как антимикробные свойства, которые очень желательны для многих применений биоинженерии. Этот метод может быть использован в качестве согласованного протокола в лабораториях, чтобы помочь менее опытным исследователям, которым требуется углубленное пошаговое выполнение процедур для получения точных результатов. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали искать протоколы антимикробной терапии, и поняли, что в литературе нет подробных протоколов по этому методу.

В этом исследовании четыре усовершенствованных материала с различной химической природой и контрольный материал будут протестированы на антимикробную активность. Подготовьте каждый материал, разрезав его на диски диаметром 10 мм. Затем стерилизуйте каждый образец путем погружения в 70% этанол на 10 минут, а затем облучите ультрафиолетовым излучением в течение одного часа с каждой стороны.

Для проверки антимикробной активности современных материалов будут использоваться три различных микроорганизма. Грамположительные бактерии Staphylococcus aureus, грамотрицательные бактерии Escherichia coli и дрожжи Candida albicans. С помощью стерильного ватного тампона ресуспендируйте несколько колоний каждого микроорганизма в 25 мл триптического соевого бульона, или TSB, содержащегося в стерильной центрифужной пробирке.

Вортекс в течение одной минуты для достижения равномерного перемешивания. Измерьте поглощение на длине волны 540 нм для каждой культуры микроорганизма с помощью спектрофотометра. Отрегулируйте концентрацию каждого микроорганизма в соответствии с подходящим числом колониеобразующих единиц, или КОЕ на миллилитр.

Ввергните микробную суспензию в течение пяти секунд, чтобы улучшить диспергирование микроорганизмов, и кратковременно погрузите стерильный ватный тампон в эту микробную суспензию. Удалите лишнюю жидкость из тампона, прижав тампон к стенке трубки, содержащей культуру. Равномерно распределите стерильную ватную палочку стерильным ватным тампоном по каждой суспензии микробного бульона на поверхность триптического соевого агара, или пластины TSA, в трех плоскостях, чтобы покрыть микроорганизмом всю поверхность.

Дайте пластинам высохнуть в течение пяти минут после прививки. Оставьте суспензии микробного бульона на столе для использования позже, чтобы проверить концентрацию и чистоту микробной суспензии. Простерилизуйте пинцет, погрузив его в стакан с 96% этанолом, а затем обжигая спиртовой горелкой.

С помощью стерильного пинцета поместите тестируемые диски с образцами в центр планшетов TSA. Инкубируйте планшеты TSA в перевернутом положении при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы проанализировать результаты диффузионного испытания, измерьте диаметр зоны торможения и диаметр диска образца с помощью цифрового штангенциркуля или путем фотографирования и использования подходящего программного обеспечения для обработки изображений.

Эта процедура необходима для проверки правильности ранее определенных концентраций микроорганизмов и обеспечения отсутствия микробного загрязнения окружающей среды. Используя микропипетку с подходящими автоклавными наконечниками и асептическими условиями, диспонируйте стерильный TSB в стерильные микроцентрифужные пробирки. Включите образец, который будет использоваться в качестве отрицательного контроля.

Выполните шесть последовательных разведений после запятой с помощью суспензий микробного бульона, использованных ранее для нанесения полос на пластины TSA. С помощью предварительно стерилизованного шпателя Дригальского распределите по 100 л каждого выбранного разведения на тарелке TSA. Разложите 100 л среды TSB без микроорганизмов на планшете TSA в качестве отрицательного контроля.

Инкубируйте планшеты TSA при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день подсчитайте количество колоний, чтобы убедиться, что КОЕ на миллилитр аналогично тому, которое было определено ранее. Проверьте отрицательную контрольную пластину, чтобы убедиться в отсутствии микробного загрязнения окружающей среды.

Начните эту процедуру с культивирования различных микроорганизмов, которые будут протестированы в TSB, в орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день измерьте OD540 каждой ночной культуры, а затем разведите каждую культуру в 20 мл TSB в предварительно стерилизованной центрифужной пробирке объемом 50 мл до концентрации примерно от десяти до шестой КОЕ на миллилитр. Поместите по четыре диска каждого вида материала и четыре контрольных диска в отдельные лунки стерильного 48-луночного планшета.

Нанесите пипеткой по 150 л микробной суспензии на каждую поверхность диска. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации 48-луночного планшета в течение 24 часов нанесите пипеткой 850 л стерильного PBS на поверхность каждого из четырех образцовых дисков и четырех контрольных дисков и смешайте его с микробной суспензией.

Соберите каждую смесь микробной суспензии PBS и каждый диск из 48-луночного планшета и переложите в предварительно простерилизованную пробирку объемом 15 мл. Вихревыми мазками PBS микробные суспензионные смеси и диски в течение одной минуты. Обрабатывайте ультразвуком с частотой 50 Гц в течение пяти минут, а затем снова делайте вихревые обработки в течение одной минуты, чтобы убедиться, что жизнеспособные микроорганизмы не прилипли к поверхности материала.

Выполняйте десятичные последовательные разведения ультразвукирующих культур и стерильных микроцентрифужных пробирок, содержащих TSB. Распределите по 100 л каждого разбавления на планшете TSA и инкубируйте планшеты аэробно при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Через 24 часа подсчитайте количество колоний и выразите это число в КОЕ на миллилитр.

Затем результаты контактного метода анализируются в соответствии с текстовым протоколом. Результаты диффузионных испытаний агарового диска показывают отсутствие антимикробной активности для первого материала и повышение антибактериальной активности в отношении S.aureus и E.coli для трех других материалов. На этом графике показано нормализованное гало для каждого диска материала против S.aureus и E.coli после 24 часов инкубации.

Результаты контактного метода также указывают на отсутствие антимикробной активности для первого материала и повышение антибактериальной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий для трех других материалов. C — это жизнеспособные бактерии, извлеченные из контрольного диска после 24 часов инкубации. На этом графике показана процентная потеря жизнеспособности четырех материалов по отношению к S.aureus и E.coli на поверхностях материала.

Образец М1 не проявлял антимикробной активности. Хотя здесь это не показано, ни один из четырех материалов не способен ингибировать рост дрожжей Candida albicans другим методом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить антимикробную активность с помощью этих двух взаимодополняющих методов.