Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани
25 августа 2018 г.
Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.
Общая цель этого видео — представить новый простой метод выделения и культивирования первичных клеток эпидермиса человека из ткани кожи взрослого человека. Этот передовой метод больше подходит для получения большого количества высокопотенциальных эпидермальных клеток как для лабораторного, так и для клинического применения. Промойте салфетку PBS перед взвешиванием.
Взвесьте кожную ткань с помощью электронных весов. Промойте ткань кожи с 70% этанолом в течение 30 секунд. Инкубируйте ткань в PBS с антибиотиками дважды по пять минут каждый раз.
Переложите ткань в другую стерильную посуду и тщательно гомогенизируйте с помощью лезвий скальпеля. Добавляйте 200 микролитров PBS каждые пять минут, чтобы сохранить ткань влажной. Переложите гомогенизированную ткань в трубку объемом 50 миллилитров.
Добавьте 10 миллилитров ферментной смеси на каждый грамм кожной ткани. Тщательно смешайте ферменты с гомогенизированными тканями. Выдержать смесь на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.
После этого добавьте 1/5 объема 0,25%трипсина. Продолжайте инкубацию в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в смесь раствор Dnase I в соотношении один к 100.
Затем высиживайте еще пять минут. Остановите процесс пищеварения, добавив такой же объем нейтрализующей среды. Подавайте раствор пипеткой вверх и вниз около 20 раз.
Отфильтруйте диссоциированные клетки через клеточный фильтр 100 микрометров, чтобы удалить остатки ткани. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Следите за гранулой на дне трубки.
Удалите надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу 10 миллилитрами нейтрализующей среды. Затем центрифугировать при 200 г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в инокуляционной среде с 10 микромолярным ингибитором ROCK.
Поместите два раза по 10 на шестую клетку в 100-миллиметровую чашку для культивирования. Через три дня замените среду для посева на бессывороточную кератиноцитарную среду. Меняйте среду каждые два дня.
Когда клетки достигнут примерно 80% плотности, пропустите клетки. Промойте клетки с помощью PBS. При необходимости трипсинизируйте в течение двух минут и промойте клетки PBS для удаления загрязненных дермальных клеток.
Добавьте такой же объем нейтрализующей среды. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Наконец, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клеточную гранулу.
Выделенные кератиноциты из тканей кожи человека инкубировали отдельно двумя методами. Традиционный метод представляет собой двухэтапное пищеварение, которое включает в себя двухдневную процедуру. В отличие от этого, новый метод представляет собой одноэтапное разложение, которое занимает около трех часов.
На третий день мы можем легко найти множество клеточных кластеров, культивируемых новым методом, в то время как при использовании традиционного метода этого явления не происходит. На пятый день было замечено, что новый метод производит большее количество первичных клеток. Для проверки статуса дифференцировки культивируемых кератиноцитов мы проанализировали базальный клеточный маркер К5 и терминальный маркер дифференцировки лорикрин.
Мы обнаружили, что 90% от общего числа клеток были K5-положительными, но менее 10% клеток экспрессировали лорикрин на третьем пассаже, что указывает на то, что они являются недифференцированными кератиноцитами. Мы проверили экспрессию виментина, который экспрессируется в дермальном фибробласте, чтобы изучить загрязнение дермальных клеток во время выделения. Мы обнаружили, что около 3% дермальных клеток появились в первоначальном пассаже, но только около 0,02% дермальных клеток были обнаружены в третьем пассаже, что указывает на высокую чистоту эпидермальных клеток после пассажа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен упрощенный протокол для изоляции первичных кератиноцитов человека из тканей кожи взрослых. Метод использует ингибитор ROCK Y-27632 для облегчения разделения эпидермальных клеток от дермальных клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Дерматология
- Регенеративная медицина
Фон
- Первичные кератиноциты человека необходимы для различных исследовательских приложений.
- Существующие методы изоляции могут быть сложными и трудоемкими.
- Использование ингибитора ROCK Y-27632 предлагает более эффективный подход.
- Изолированные кератиноциты могут использоваться как в лабораторных, так и в клинических условиях.
Цель исследования
- Разработать более эффективный метод изоляции эпидермальных клеток.
- Увеличить выход клеток эпидермиса с высоким потенциалом.
- Облегчить исследовательские и клиническое применение, связанное с клетками кожи.
Использованные методы
- Промойте ткань кожи PBS перед взвешиваниям.
- Взвесьте ткань кожи на электронной весе.
- Промойте ткань 70% этиловым спиртом в течение 30 секунд.
- Инкубируйте ткань в PBS с антибиотиками дважды по пять минут каждый раз.
Основные результаты
- Протокол успешно изолирует первичные кератиноциты.
- Были получены высокие выходы жизнеспособных эпидермальных клеток.
- Метод является воспроизводимым и эффективным.
- Изолированные клетки могут быть использованы для различных приложений.
Выводы
- Этот метод упрощает изоляцию первичных кератиноцитов.
- Он предоставляет надежный подход для исследователей в этой области.
- Использование ингибитора ROCK увеличивает выход и жизнеспособность клеток.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
