Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Общая цель этого видео — представить новый простой метод выделения и культивирования первичных клеток эпидермиса человека из ткани кожи взрослого человека. Этот передовой метод больше подходит для получения большого количества высокопотенциальных эпидермальных клеток как для лабораторного, так и для клинического применения. Промойте салфетку PBS перед взвешиванием.

Взвесьте кожную ткань с помощью электронных весов. Промойте ткань кожи с 70% этанолом в течение 30 секунд. Инкубируйте ткань в PBS с антибиотиками дважды по пять минут каждый раз.

Переложите ткань в другую стерильную посуду и тщательно гомогенизируйте с помощью лезвий скальпеля. Добавляйте 200 микролитров PBS каждые пять минут, чтобы сохранить ткань влажной. Переложите гомогенизированную ткань в трубку объемом 50 миллилитров.

Добавьте 10 миллилитров ферментной смеси на каждый грамм кожной ткани. Тщательно смешайте ферменты с гомогенизированными тканями. Выдержать смесь на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.

После этого добавьте 1/5 объема 0,25%трипсина. Продолжайте инкубацию в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в смесь раствор Dnase I в соотношении один к 100.

Затем высиживайте еще пять минут. Остановите процесс пищеварения, добавив такой же объем нейтрализующей среды. Подавайте раствор пипеткой вверх и вниз около 20 раз.

Отфильтруйте диссоциированные клетки через клеточный фильтр 100 микрометров, чтобы удалить остатки ткани. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Следите за гранулой на дне трубки.

Удалите надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу 10 миллилитрами нейтрализующей среды. Затем центрифугировать при 200 г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в инокуляционной среде с 10 микромолярным ингибитором ROCK.

Поместите два раза по 10 на шестую клетку в 100-миллиметровую чашку для культивирования. Через три дня замените среду для посева на бессывороточную кератиноцитарную среду. Меняйте среду каждые два дня.

Когда клетки достигнут примерно 80% плотности, пропустите клетки. Промойте клетки с помощью PBS. При необходимости трипсинизируйте в течение двух минут и промойте клетки PBS для удаления загрязненных дермальных клеток.

Добавьте такой же объем нейтрализующей среды. Центрифугируйте при 200 г в течение пяти минут. Наконец, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клеточную гранулу.

Выделенные кератиноциты из тканей кожи человека инкубировали отдельно двумя методами. Традиционный метод представляет собой двухэтапное пищеварение, которое включает в себя двухдневную процедуру. В отличие от этого, новый метод представляет собой одноэтапное разложение, которое занимает около трех часов.

На третий день мы можем легко найти множество клеточных кластеров, культивируемых новым методом, в то время как при использовании традиционного метода этого явления не происходит. На пятый день было замечено, что новый метод производит большее количество первичных клеток. Для проверки статуса дифференцировки культивируемых кератиноцитов мы проанализировали базальный клеточный маркер К5 и терминальный маркер дифференцировки лорикрин.

Мы обнаружили, что 90% от общего числа клеток были K5-положительными, но менее 10% клеток экспрессировали лорикрин на третьем пассаже, что указывает на то, что они являются недифференцированными кератиноцитами. Мы проверили экспрессию виментина, который экспрессируется в дермальном фибробласте, чтобы изучить загрязнение дермальных клеток во время выделения. Мы обнаружили, что около 3% дермальных клеток появились в первоначальном пассаже, но только около 0,02% дермальных клеток были обнаружены в третьем пассаже, что указывает на высокую чистоту эпидермальных клеток после пассажа.