Генерация Интеграция-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, используя волос производный Кератиноциты

Общая цель этой процедуры заключается в создании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с использованием кератиноцитов, полученных из волос. Это достигается путем выделения волос от донора. Второй шаг заключается в уменьшении волосков, чтобы облегчить рост кератиноцитов.

Далее кератиноциты поддерживаются и расширяются in vitro. Заключительным этапом является перепрограммирование кератиноцитов в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки с использованием метода эписомального перепрограммирования. В конечном счете, человеческие IPS-клетки могут быть выделены и охарактеризованы с помощью иммуногистохимии, чтобы показать экспрессию плюрипотентных маркеров.

Общее преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ретровирусный или лентивирусный метод, заключается в том, что, используя эписомальный фактор, мы избегаем нежелательного трансгена. Интеграция в геном в стволовые клетки, которые генерируются, начинается путем размораживания флакона с раствором внеклеточного матрикса на льду в течение ночи. На следующее утро с помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток добавьте 200 микролитров раствора в 12 миллилитрах охлажденной среды DM F 12.

Добавьте по одному миллилитру разведенного раствора внеклеточного матрикса в каждую лунку по 12 штук. Луночную пластину и инкубируйте пластину на ночь при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы покрыть лунки матрицей. Затем соберите первичные человеческие волосы с головы донора, поместив пальцы близко к корню волоса и выщипывая волосы одним быстрым и плавным движением.

Убедитесь, что каждый собранный волос содержит неповрежденный волосяной фолликул. Поместите фолликул под препарирующий микроскоп и определите фазу роста каждого волоска. Соберите от пяти до 10 антигенных волосков от каждой особи, чтобы извлечь ороговевший лед.

Фаза антигена, в отличие от Т-фазы, содержит несколько слоев эпителия. Поместите образцы волос в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров смеси антибиотиков, на пять минут, а затем промойте их в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем захватите волосы стерильными щипцами и с помощью стерильных ножниц отрежьте лишний стержень волоса, оставив фрагмент волоса с неповрежденным волосяным фолликулом и примерно от 0,5 до одного сантиметра волосяного стержня.

Осторожно перенесите по одному фрагменту волоса в каждую лунку пластины, покрытой внеклеточным матриксом. С помощью стерильных щипцов я ввожу примерно от 100 до 200 микролитров заменителя сыворотки. Средне по капле в каждую лунку, содержащую образцы волос.

Затем поместите планшет в инкубатор и дайте фолликулам прикрепиться на ночь при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на следующий день. Аккуратно добавьте еще от 100 до 200 микролитров заменителя сыворотки, по каплям, чтобы образцы волос оставались влажными. Ежедневно проверяйте образцы волос, чтобы подтвердить, что волосяные фолликулы успешно прикрепились к пластине.

После присоединения аккуратно добавьте в лунку еще 500 микролитров среды. Меняйте носители каждые два дня. Preco - настенная пластина с шестью стенками с коллагеном.

Тип первый: с использованием предварительной обработки, такой как набор матриц покрытия, в 680 микролитров разбавляющей среды из набора в каждую лунку, за которой следует 6,8 микролитра матричного раствора покрытия. Осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие. Дайте пластине с покрытием инкубироваться в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем наносить покрытие кератиноцитами.

Удалите покрывающий раствор, диссоциируйте кератиноциты в культуре в одноклеточную суспензию, добавив 500 микролитров 0,25% трипзина на лунку, и инкубируйте планшеты в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Как только клетки высвободятся из пластины, инактивируйте трипсин с помощью 500 микролитров сыворотки, содержащей среду, и соберите клетки в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Удалите фрагмент волоса с помощью стерилизованных щипцов, гранулируйте клетки, а затем восстановите.

Суспендируйте их в свежей кератиноцитарной среде роста 40 000 кератиноцитов в одну лунку пластины, покрытой коллагеном, в присутствии кератиноцитарной среды. Меняйте среды каждый день и пропускайте клетки при примерно 80%-ном слиянии V-кода в шестистенную пластину с желатином, добавив в каждую по два миллилитра 0,1%-ного раствора желатина, хорошо дайте желатину покрыться не менее 20 минут при комнатной температуре. Тем временем диссоциируйте кератиноциты, которые проходят шесть или ниже, в одноклеточную суспензию, добавив один миллилитр 0,25% триина в лунку и инкубируя клетки в течение двух-пяти минут.

При температуре 37 градусов Цельсия инактивируйте трипсин одним миллилитром среды, содержащей сыворотку, и соберите клетки в 15-миллилитровую пробирку. Гранулируйте клетки и ресуспендируйте их в кератиноцитарной среде. Затем поместите от 100 000 до 150 000 кератиноцитов на лунку в желатинизированный шестилуночный планшет и инкубируйте их на следующий день, в нулевой день, проверьте планшет, чтобы убедиться, что клетки сливаются на 50-60%.

Выполните трансфекцию эписомальных векторов перепрограммирования на кератиноцитах с использованием соотношения восемь микролитров реагента для трансфекции к двум микрограммам общей плазменной ДНК, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. На следующий день, в первый день, смените кератиноцитарную среду и проверьте эффективность трансфекции, оценив процент зеленых флуоресцентных белковых положительных клеток под флуоресцентным микроскопом. Эффективность трансфекции ожидается на уровне от 60 до 70% уже на второй день.

Повторите трансфекцию, чтобы повысить эффективность трансфекции до более чем 90%Затем предварительно закодируйте 10-сантиметровую чашку пятью миллилитрами 0,1% желатина в течение не менее 20 минут. Поместите 4 миллиона митотически инактивированных питающих клеток на 10-сантиметровую чашку в среду FBS, как описано в Conrad Al all, и дайте клеткам осесть и прикрепиться на ночь в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа на третий день. Соберите трансфицированные кератиноциты, как показано ранее, и ресуспендируйте их в средней пластине KSR.

90% кератиноцитов из одной из лунок в 10-сантиметровую чашку готовят с питающими клетками и накрывают их КСР. Среда Изолируйте индуцированные человеком колонии плюрипотентных стволовых клеток путем ручного препарирования с 21-го дня. Избегайте колоний, которые тесно сгруппированы друг к другу, и выбирайте только те колонии, которые четко отделены друг от друга.

Для ручного вскрытия используйте иглу 26 калибра, чтобы разрезать колонии на мелкие кусочки длиной от 300 до 600 микрометров под микроскопом. Перенесите кусочки из одной колонии в новую подающую пластину MEF, чтобы создать клональную линию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Как только культура достигает от 70 до 80% конвенции с индуцированными человеческими колониями плюрипотентных стволовых клеток диаметром около 1,5 миллиметров, клетки используют стандартные методы ферментативной упаковки, такие как аккутан, саза или коллагеназа.

Четыре, согласно инструкции производителя. При следовании этому протоколу отростки могут наблюдаться уже через три дня после прикрепления волос и будут продолжать разрастаться. Показанные здесь кератиноциты были перенесены на новую пластину, и эти клетки могут поддерживаться в течение нескольких пассажей.

На этом изображении показана типичная колония плюрипотентных стволовых клеток, полученная из кератиноцитов человека. После 32 дней перепрограммирования может произойти некоторая дифференцировка в центре индуцированной человеческой колонией плюрипотентных стволовых клеток. После ручного отбора полученные клетки обычно демонстрируют высокое соотношение ядра к цитоплазме и определенную границу колонии.

Они также экспрессируют ряд плюрипотентных маркеров, таких как ОКТ, четыре нага и ТРА один 60. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как извлечь кератиноциты из волос и перепрограммировать их в индуцированные человеком предполагаемые стволовые клетки.