Изучение потенциала мезенхимальных стволовых клеток листа на развитие гепатоцеллюлярной карциномы In Vivo

Здравствуйте, я доктор Алаа Альшарида из Международного медицинского исследовательского центра имени короля Абдаллы на кафедре стволовых клеток и регенеративной медицины. Сегодня мы продемонстрируем влияние мезенхимальных стволовых клеток на развитие гепатоцеллюлярной карциномы на модели крысы с использованием технологии клеточных листов. Здравствуйте, меня зовут Абдулла Альмубарак.

Я работаю в лаборатории экспериментальной хирургии и животных в Университете короля Сауда. Мы используем голую крысу, чтобы избежать любых отторжений после пересадки клеточного листа. На этой схеме показана процедура трансплантации клеточного листа на голых крысах.

В этом исследовании будут использоваться голые крысы в возрасте от 8 до 12 недель. Сначала срежьте крыс и сделайте семи-десятисантиметровый разрез между кожей и нижележащими мышцами с помощью скальпеля, чтобы обнажить печень. Для переноса клеточного листа используют стерильную мембрану.

Поместите мембрану на лист клетки, чтобы собрать ее. Затем поместите клеточный лист с мембраной над одной долей печени. Конструкция ячеистого листа.

Перед посевом клеток покройте 3,5-сантиметровые термочувствительные чашки для культур UpCell неразбавленным FBS. Покрытие чашек FBS поддерживает рост клеток в мембранном слое и предотвращает деградацию клеток. Обязательно покройте всю поверхность посуды.

Инкубируйте чашки в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха. На следующий день удалите излишки FBS и дайте посуде высохнуть при комнатной температуре не менее одного часа. Посадите не менее одного миллиона раковых клеток HepG2 отдельно или совместно с мезенхимальными стволовыми клетками в культуральную среду DMEM.

Среду дополняют 10%-ным FBS и 1%-ным пенициллин-стрептомицином. Соотношение раковых клеток и мезенхимальных стволовых клеток, используемое в этом исследовании, составляет 4:1. После добавления клетки аккуратно встряхивают посуду.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха. Отслоение клеточного листа. При 100% слиянии клеток вынимайте посуду из инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия.

Теперь инкубируйте лист раковой клетки HepG2 в течение одного часа при комнатной температуре, в то время как инкубируйте HepG2, совместно культивируемый с мезенхимальными стволовыми клетками, в течение 30-40 минут при температуре 20 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа при 95% воздуха. Во время инкубации для отделения клеточного листа приступают к животным процедурам. Все исследования на животных были одобрены этическим комитетом Университета короля Сауда.

Проведение хирургического вмешательства. Проверьте глубину анестезии, проверив рефлекс отвода педали. Продезинфицируйте операционную зону йодом.

Теперь нанесите второй скраб с йодом. Накройте животное стерилизованной простыней, чтобы избежать загрязнения разреза. С помощью стерилизованного скальпеля сделайте надрез между кожей и нижележащими мышцами, размером от семи до десяти сантиметров, чтобы обнажить печень.

Отделите мышцы живота от кожи плоским задним краем скальпеля. Аккуратно проколите белую линию с помощью скальпеля и растяните порез острыми ножницами. Трансплантация клеточного листа на печень крысы.

Аккуратно постучите по тарелке над скамейкой, чтобы отсоединить лист от его поверхности. Отделите лист ячеек от поверхности посуды, соскоблив края листа полукругом. Теперь аккуратно удалите всю питательную среду из формы.

Убедитесь, что лист не поврежден и не поврежден, в противном случае его нельзя использовать. Подготовьте стерильную мембрану для забора и переноса клеточного листа. Поэтому сначала пропитайте мембрану обычным физиологическим раствором, затем удалите излишки солевого раствора стерильной ватной палочкой.

Поместите влажную мембрану поверх клеточного листа, избегая при этом пузырьков воздуха между мембраной и клеточным листом. Добавьте несколько капель обычного физиологического раствора на мембрану и клеточный лист, чтобы собрать материал. Оставьте мембрану на несколько секунд, чтобы убедиться, что клеточный лист правильно прикреплен к мембране, затем соберите его.

Теперь подготовьте печень к трансплантации. Убедитесь, что поверхность печени сухая. Поместите мембрану с клеточным листом над одной долей печени крысы.

Добавьте несколько капель стерилизованного физиологического раствора, чтобы отделить клеточный лист от мембраны. Подождите пять минут, прежде чем осторожно снять мембрану. Клеточный лист можно увидеть прикрепленным к печени на этом видео.

Наконец, закройте нижележащие мышцы и разрезы кожи пятью нейлоновыми швами. После закрытия разреза продезинфицируйте область операции бетадином. Время от снятия анестезии до поднятия головы варьируется, но обычно составляет от пяти до 20 минут.

На этом рисунке показана развившаяся опухоль на печени крысы через месяц после трансплантации клеточного листа HepG2. Здесь опухоль была разработана после трансплантации клеточных пластин раковых клеток HepG2 и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. В то время как на этом рисунке показана самая маленькая развитая опухоль на печени крысы после трансплантации клеточного листа, изготовленного из раковых клеток HepG2 и мезенхимальных стволовых клеток пуповинного хорда, на этом рисунке показано окрашивание H и E печени крысы после одного месяца трансплантации клеточного листа.

Где А представляют нормальные клетки печени крысы, а В — клетки печени раковой крысы. Заключение. Таким образом, после просмотра этого видео вы сможете разработать модель гепатоцеллюлярной карциномы на голой крысе с использованием технологии клеточных листов. Спасибо за просмотр.