Вынуждены слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции комаров
7 августа 2018 г.
Для эффективного контроля комаров несут передачи вируса знание Векторный потенциал соответствующих комаров представляет особый интерес. Мы описываем принудительного слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции Aedes albopictus и три различных таксонов Culex для передачи вируса Зика.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области болезней, переносимых комарами, например, является ли вид комаров компетентным переносчиком определенного вируса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что большое количество комаров можно анализировать одновременно, без использования лабораторных животных, таких как мыши. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что он требует навыков мелкой моторики, которые можно приобрести только через практику.
Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, так как ключевые шаги сложны для изучения; Они требуют опыта работы с комарами и вирусами, а также мелкой моторики. Для начала разведите вирусный запас. Затем смешайте просроченную человеческую кровь с фруктозой, отфильтрованной бычьей сывороткой и вирусным запасом.
Заморозьте 140 микролитров смеси кровяной муки для дальнейшего анализа с помощью TCID50. Далее положите две капли смеси для кровяной муки по 50 микролитров в пластиковый флакон и дайте комарам покормиться в течение двух часов. После обезболивания комаров подсчитайте полностью набухших особей и переложите их в новый флакон, содержащий ватный диск, смоченный во фруктозе.
Затем поддерживайте комаров при температуре 27 градусов по Цельсию и влажности 80% в течение 14 или 21 дня. Пополняйте насыщенные фруктозой ватные диски каждые 72 часа 1,5 миллилитрами фруктозы. Сначала засейте 20 000 клеток Vero в лунку в 96-луночный планшет с добавленной питательной средой.
Чтобы приготовить устройство для слюноотделения, поставьте на скамью квадратную стеклянную пластину под углом 30 градусов. Затем приклейте двусторонний скотч к верхней части стеклянной пластины. Далее раскатайте пластилин до его диаметра 0,5 сантиметра, и приложите его к плите горизонтально на расстоянии одного сантиметра от двустороннего скотча.
Отрежьте наконечники от необходимого количества 10-микролитровых фильтрующих наконечников и заполните каждый наконечник 10 микролитрами PBS. Затем поместите кончики на пластилин и закрепите их с легким нажимом. Далее обездвижите комаров, удалив им ноги и крылья.
Закрепите комаров на ленте над наконечниками фильтров. Аккуратно поместите хоботок каждого комара в наконечник фильтра. Через 30 минут снимите наконечники фильтра, а глину и скотч выбросьте.
Переложите собранную слюну в реакционные пробирки, содержащие 10 микролитров PBS. Осторожно смешайте слюну и PBS и переложите смесь в лунки 96-луночной пластины. Инкубируйте тарелку в течение семи дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.
С помощью светового микроскопа проверяют клетки на наличие цитопатического эффекта. Как только лунка станет положительной на цитопатический эффект, используйте пипетку для сбора 140 микролитров надосадочной жидкости. Затем перенесите надосадочную жидкость в реакционную трубку.
Далее смешайте 140 микролитров надосадочной жидкости с 560 микролитрами буфера AVL, и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, добавьте 560 микролитров этанола и переверните образец для перемешивания. Используя этот протокол, несколько видов комаров были протестированы на инфекцию вируса Зика и передачу в различных климатических условиях.
При температуре 27 градусов Цельсия при температуре инкубации у всех видов Aedes наблюдалась слюна, положительная на вирус Зика. И наоборот, ни один из образцов слюны таксонов Culex не содержал доказательств вируса. После освоения этой техники ее можно выполнить для 50 комаров за один час при правильном выполнении.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты с принудительным слюноотделением. Не забывайте, что работа с инфицированными комарами может быть очень опасной, поэтому при проведении любого эксперимента всегда следует соблюдать специальные меры безопасности при обращении с комарами в условиях BSA-3.
Обзор
Эта статья обсуждает метод анализа векторной компетенции комаров, конкретно Aedes albopictus и различных таксонов Culex, для передачи вируса Зика. Техника вынужденной слюноотделения позволяет проводить одновременный анализ нескольких комаров без использования лабораторных животных.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология векторов
- Вирусология
- Заболевания, передаваемые комарами
Предыстория
- Понимание векторной компетенции важно для контроля вирусов, передаваемых комарами.
- Вынужденная слюноотделение - новый метод оценки потенциала передачи вирусов комарами.
- Предыдущие методы часто требовали лабораторных животных, что техника стремится устранить.
- Тонкие двигательные навыки необходимы для этого метода, требующие практики и опыта.
Цель исследования
- Оценить векторную компетенцию различных видов комаров для вируса Зика.
- Продемонстрировать метод, позволяющий проводить высокопроизводительный анализ слюны комара.
- Предоставить визуальное руководство для исследователей, недавно знакомых с техникой.
Используемые методы
- Приготовление смеси крови для кормления комаров.
- Техника вынужденной слюноотделения для сбора слюны от комара.
- Методы культуры клеток для оценки наличия вируса Зика.
- Инкубация и анализ образцов на цитопатические эффекты.
Основные результаты
- Вид Aedes показал положительную слюну на вирус Зика в контролируемых условиях.
- Таксоны Culex не продемонстрировали наличие вируса Зика в своей слюне.
- Метод позволяет тестировать до 50 комара в один час после освоения.
- Визуальные демонстрации значительно помогают в изучении техники.
Выводы
- Вынужденная слюноотделение - эффективный метод для изучения передачи вирусов, передаваемых комарами.
- Обучение и практика необходимы для успешного внедрения техники.
- При работе с зараженными комарами должны соблюдаться меры безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
