Вынуждены слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции комаров

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области болезней, переносимых комарами, например, является ли вид комаров компетентным переносчиком определенного вируса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что большое количество комаров можно анализировать одновременно, без использования лабораторных животных, таких как мыши. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что он требует навыков мелкой моторики, которые можно приобрести только через практику.

Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, так как ключевые шаги сложны для изучения; Они требуют опыта работы с комарами и вирусами, а также мелкой моторики. Для начала разведите вирусный запас. Затем смешайте просроченную человеческую кровь с фруктозой, отфильтрованной бычьей сывороткой и вирусным запасом.

Заморозьте 140 микролитров смеси кровяной муки для дальнейшего анализа с помощью TCID50. Далее положите две капли смеси для кровяной муки по 50 микролитров в пластиковый флакон и дайте комарам покормиться в течение двух часов. После обезболивания комаров подсчитайте полностью набухших особей и переложите их в новый флакон, содержащий ватный диск, смоченный во фруктозе.

Затем поддерживайте комаров при температуре 27 градусов по Цельсию и влажности 80% в течение 14 или 21 дня. Пополняйте насыщенные фруктозой ватные диски каждые 72 часа 1,5 миллилитрами фруктозы. Сначала засейте 20 000 клеток Vero в лунку в 96-луночный планшет с добавленной питательной средой.

Чтобы приготовить устройство для слюноотделения, поставьте на скамью квадратную стеклянную пластину под углом 30 градусов. Затем приклейте двусторонний скотч к верхней части стеклянной пластины. Далее раскатайте пластилин до его диаметра 0,5 сантиметра, и приложите его к плите горизонтально на расстоянии одного сантиметра от двустороннего скотча.

Отрежьте наконечники от необходимого количества 10-микролитровых фильтрующих наконечников и заполните каждый наконечник 10 микролитрами PBS. Затем поместите кончики на пластилин и закрепите их с легким нажимом. Далее обездвижите комаров, удалив им ноги и крылья.

Закрепите комаров на ленте над наконечниками фильтров. Аккуратно поместите хоботок каждого комара в наконечник фильтра. Через 30 минут снимите наконечники фильтра, а глину и скотч выбросьте.

Переложите собранную слюну в реакционные пробирки, содержащие 10 микролитров PBS. Осторожно смешайте слюну и PBS и переложите смесь в лунки 96-луночной пластины. Инкубируйте тарелку в течение семи дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

С помощью светового микроскопа проверяют клетки на наличие цитопатического эффекта. Как только лунка станет положительной на цитопатический эффект, используйте пипетку для сбора 140 микролитров надосадочной жидкости. Затем перенесите надосадочную жидкость в реакционную трубку.

Далее смешайте 140 микролитров надосадочной жидкости с 560 микролитрами буфера AVL, и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, добавьте 560 микролитров этанола и переверните образец для перемешивания. Используя этот протокол, несколько видов комаров были протестированы на инфекцию вируса Зика и передачу в различных климатических условиях.

При температуре 27 градусов Цельсия при температуре инкубации у всех видов Aedes наблюдалась слюна, положительная на вирус Зика. И наоборот, ни один из образцов слюны таксонов Culex не содержал доказательств вируса. После освоения этой техники ее можно выполнить для 50 комаров за один час при правильном выполнении.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты с принудительным слюноотделением. Не забывайте, что работа с инфицированными комарами может быть очень опасной, поэтому при проведении любого эксперимента всегда следует соблюдать специальные меры безопасности при обращении с комарами в условиях BSA-3.