Альфавирус трансдуцирующих Система: Инструмент для визуализации инфекции у комаров-переносчиков

Альфа-вирусы — это РНК-вирусы, рожденные комарами, которые стойко заражают восприимчивые клетки комаров с минимальной цитопатологией. Этот протокол демонстрирует полезность инфекционных систем передачи альфа-вируса, которые экспрессируют флуоресцентные репортеры для обнаружения векторной инфекции и передачи вируса. Сначала накормите самок комаров кровяной пищей, содержащей интересующий вас альфа-вирус, затем определите эффективность заражения комарами и выберите только комаров, экспрессирующих ген маркера.

Затем соберите слюну у инфицированных комаров и продемонстрируйте трансмиссивность, заразив культивируемые клетки комаров собранной слюной. Результаты получены методом эпифлуоресцентной микроскопии. Визуализируйте отчет о белке, таком как GFP, и таким образом отслеживайте векторную инфекцию и передачу вируса восьмидесятыми или QE видами комаров.

Системы экспрессии альфа-вирусов или ATS могут быть использованы для быстрой оценки экспрессии генов и векторных комаров как в исследованиях арбовирусов, так и перед выполнением более сложных манипуляций с комарами, таких как трансгенез комаров. Демонстрировать эти процедуры будут д-р Ирма Санчес Варгас, д-р Эрик Моссел и Аарон Филлипс из лаборатории д-ра Кена Олсона. Для того, чтобы получить вирус TS в клетках Bhk 21, используют рекомбинантный вирус symbis, который экспрессирует репортер GFP после транскрипции in vitro, электроrate РНК системы трансдуцирования геномного альфа-вируса в клетки bhk 21.

Затем спасите и усилите вирус до того, как инфекция будет инфицирована. Прайм комаров для эффективного питания кровью из искусственной кормушки путем лишения пищи. Удалите сахар за 24 часа и воду за 12 часов до кормления.

Смешанная коммерчески полученная дефибрилляционная или цитратированная кровь животных с полученной клеточной культурой полученной суспензией вируса TS для эффективной инфекции средней кишки комаров. Сформулируйте от 10 до семи бляшечных единиц на миллилитр титра вируса для кровяной муки, чтобы стимулировать комаров к набуханию. Добавьте TP до конечной концентрации 0,02 моляра.

Поместите мембрану кишечника с признаком пор над горлышком стеклянной кормушки с водяной рубашкой. Далее устанавливаем кормушки с циркуляцией воды 37 градусов по Цельсию. Затем заведите пипеткой муку в камеру и надежно разместите кормушки на картонной коробке.

После кормления комаров в течение 10-30 минут отсортируйте комаров под наркозом от холода на наличие образцов, набухших кровью, чтобы обеспечить репликацию и распространение вируса TS в выбранных комарах. Инкубируйте их при температуре 28 градусов Цельсия и относительной влажности 75% в течение восьми-10 дней. Для того, чтобы обездвижить комаров.

Поместите картонную коробку с бумагой при температуре четыре градуса Цельсия примерно на 15 минут. Теперь перенесите от пяти до 10 комаров на охлаждающий стол, который приспособлен для использования на флуоресцентном микроскопе. Осмотрите и отсортируйте комаров на основе наличия или отсутствия флуоресценции.

Верните выбранных комаров в картонную коробку для использования по желанию. На этом этапе определите эффективность инфекции, используя интенсивность флуоресценции в качестве прокси. Наконец, препарируйте такие ткани, как средняя кишка, SIV железы и жировые тела, и следите за флуоресценцией.

При желании эти органы и ткани могут быть препарированы в более ранние сроки. Лишите комаров источника сахара за 24 часа до кормления. Подготовьте капиллярную трубку объемом 50 микролитров, которую нагрели, вытянули и отрезали от трех до пяти микролитров Cargill.

Погружное масло типа B для предотвращения побега комаров. Удалите у них ноги и крылья. Теперь вставьте пробо в трубку.

Внимательно следите за каплями слюны, которые выделяются из пробос в погружное масло. При необходимости капните каплю 1%-ного пилокарпина на грудную клетку комара для увеличения слюноотделения через 60-90 минут, удалите комаров и сохраните их для будущей изоляции вируса. Теперь, чтобы собрать раствор из капиллярной трубки, вытолкните смесь слюноотделения в пробирку, содержащую 500 микролитров 20% стерильного F-B-S-P-B-S.

Отфильтруйте инокулюм через шприцевой фильтр 0,2 микрона, а затем используйте этот инокулюм для заражения культивируемых клеток в клетках комаров. Эффективность инфекции пятью простыми вирусами DS MRE 16 GFP оценивается по экспрессии GFP. Со временем эти клетки были инфицированы вирусом при кратности 0,01 инфекции.

Эпифлуоресцентный микроскоп позволяет видеть GFP у инфицированного комара, а также в различных частях тела здесь через 10 дней после заражения. Органная селективная экспрессия GFP указывает на диссеминированную инфекцию. Средние отделы кишечника обычно имеют отчетливые очаги инфекции вскоре после приема крови, содержащей вирус, который распространяется по всей задней средней кишке в более поздние периоды после заражения.

Об этих событиях сигнализируют репортеры GFP и DS RED. Анализ передачи показывает, что пять основных вирусов DS MRE 16 GFP стабильно экспрессируют GFP на протяжении всего внешнего инкубационного периода. У комаров здесь GFP и слюна комара обнаруживаются уже через восемь дней после заражения.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как заразить комара вирусом A TS, как визуально оценить заражение вирусом у комара и как оценить передачу вируса от комара.