Альфавирус трансдуцирующих Система: Инструмент для визуализации инфекции у комаров-переносчиков

Альфавирусы представляют собой РНК-вирусы, переносимые комарами, которые персистивно инфицируют восприимчивые клетки комаров с минимальной цитопатологией. В данном протоколе демонстрируется эффективность использования инфекционных трансдуцирующих систем альфавирусов, экспрессирующих флуоресцентные репортеры для обнаружения инфицирования переносчика и передачи вируса. Сначала самкам комаров скармливают порцию крови, содержащую исследуемый альфавирус, затем определяют эффективность инфицирования комаров и отбирают только тех особей, которые экспрессируют маркерный ген.

Затем соберите слюну из инфицированных комаров и продемонстрируйте трансмиссивность, инфицировав культивируемые клетки комаров собранной слюной. Результаты obtained с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Визуализируйте репортерный белок, такой как GFP, и таким образом отследите инфицирование переносчика и передачу вируса представителями видов Aedes или Culex.

Системы экспрессии альфавирусов или ATS могут быть использованы для быстрой оценки экспрессии генов и проверки комаров-векторов как в исследованиях арбовирусов, так и перед проведением более сложных манипуляций с насекомыми, таких как трансгенез комаров. Эти процедуры продемонстрируют д-р Ирма Санчес Варгас, д-р Эрик Моссел и Аарон Филлипс из лаборатории д-ра Кена Олсона. Чтобы получить вирус TS в клетках Bhk 21, используйте рекомбинантный вирус symbis, который экспрессирует репортер GFP после транскрипции in vitro, и проведите электропорирование РНК трансдуцирующей системы альфавируса в клетки bhk 21.

Затем выделите и амплифицируйте вирус перед заражением. Для обеспечения эффективного питания комаров из искусственного фидера проведите их подготовку путем лишения пищи. Удалите сахар за 24 часа и воду за 12 часов до кормления.

Смешайте коммерчески полученную дефибриллированную или цитратную кровь животных с подготовленной клеточной культурой, чтобы получить суспензию вируса TS для эффективного заражения средней кишки комаров. Подготовьте титр вируса в кровяной порции в концентрации 10⁷ бляшкообразующих единиц на миллилитр, чтобы стимулировать комаров к насыщению. Добавьте TP до конечной концентрации 0,02 M.

Поместите кишечную мембрану с порами на горлышко стеклянного дозатора с водяной рубашкой. Затем подготовьте дозаторы, обеспечив циркуляцию воды с температурой 37 °C. После этого пипеткой внесите корм в камеру и надежно закрепите дозаторы на картоне.

После кормления комаров в течение 10–30 минут отберите из холодно-анестезированных особей экземпляры, насытившиеся кровью, чтобы обеспечить репликацию и распространение вируса TS в выбранных насекомых. Инкубируйте их при температуре 28 °C и относительной влажности 75% в течение 8–10 дней. Для иммобилизации комаров.

Поместите картонную коробку с насекомыми при температуре 4 °C примерно на 15 минут. Затем перенесите от 5 до 10 комаров на охлаждающий столик, адаптированный для использования с флуоресцентным микроскопом. Осмотрите и отсортируйте комаров в зависимости от наличия или отсутствия флуоресценции.

Поместите выбранных комаров обратно в картонную коробку для дальнейшего использования по назначению. На этом этапе определите эффективность заражения, используя интенсивность флуоресценции в качестве косвенного показателя. В завершение проведите диссекцию таких тканей, как средняя кишка, слюнные железы и жировое тело, и проконтролируйте наличие флуоресценции.

При желании эти органы и ткани можно препарировать в более ранние сроки. За 24 часа до кормления лишите комаров источника сахара. Подготовьте капиллярную трубку объемом 50 µL, которая была нагрета, вытянута и обрезана, заполнив ее от 3 до 5 µL Cargill.

Залейте иммерсионное масло типа B, чтобы предотвратить побег комаров. Удалите их ноги и крылья. Теперь вставьте хоботок в трубку.

Внимательно наблюдайте за каплями слюны, выделяющимися из хоботка в иммерсионное масло. При необходимости нанесите каплю 1% пилокарпина на грудной отдел комара для стимуляции слюноотделения. Через 60–90 минут извлеките комаров и поместите их на хранение для последующего выделения вируса. Для сбора раствора из капиллярной трубки вытесните смесь слюны и масла в пробирку, содержащую 500 µL стерильного 20% F-B-S-P-B-S.

Профильтруйте инокулят через шприцевой фильтр с порами 0,2 micron, а затем используйте этот инокулят для заражения культур клеток комара. Эффективность заражения вирусом five prime DS MRE 16 GFP оценивают по экспрессии GFP. В течение определенного времени эти клетки заражали вирусом с множественностью заражения 0.01.

Эпифлуоресцентный микроскоп позволяет визуализировать GFP во всем теле инфицированного комара, а также в отдельных частях тела, как показано здесь на 10-й день после заражения. Орган-специфическая экспрессия GFP указывает на диссеминированную инфекцию. В средней кишке обычно наблюдаются отчетливые очаги инфекции вскоре после заглатывания порции крови, содержащей вирус, который впоследствии распространяется по всей задней части средней кишки.

Эти события регистрируются с помощью репортеров GFP и DS RED. Анализ передачи показывает, что вирус five prime DS MRE 16 GFP стабильно экспрессирует GFP на протяжении всего периода внешней инкубации. У данного комара GFP обнаруживается в слюнных железах уже через восемь дней после заражения.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить пероральное заражение комара вирусом A TS, как визуально оценивать инфицирование комара вирусом и как оценивать передачу вируса комаром.