Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора
17 апреля 2019 г.
Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.
Используя этот метод, мы можем непосредственно изучат образование сердечной трубки, цикл и полное образование камер без дальнейших экспериментальных манипуляций эмбриона мыши. Хотя, мы используем MLC-2v-tdTomato мышей в качестве примера, этот простой метод может быть широко использован с другими флуоресцентными линиями мыши репортера. Основным преимуществом этого протокола является то, что он очень прост и не требует каких-либо сложных методов или оборудования.
Это может быть выполнено в обычной обстановке лаборатории. После спаривания самки с мышами мужского пола, как MLC-2v-tdTomato от 8 до 10 недель, проверить плотины для вагинальных пробки каждое утро. Положите беременных плотин, усыпляют в разные дни после coitum, в положении на спине и спрей живота с 70%этанола.
Используйте острые хирургические ножницы и миппы, чтобы открыть брюшную полость путем разреза кожи и брюшной стенки. После обнаружения двусторонних рогов матки в спинной части брюшной полости, отделить всю матку с помощью острых хирургических ножниц и типсов, чтобы тщательно сократить выше яйцеклетки с обеих сторон. Поместите всю вскрытую матку в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS.
Используя острые хирургические ножницы и типсы, тщательно отделяйте каждый амниотический мешок вдоль рога матки. Используйте пинцет для переноса каждого эмбриона в 35-миллиметровую культурную пластину, наполненную ледяным PBS. Используя острые хирургические ножницы и типсы, откройте амниотический мешок и разоблачите каждый эмбрион, отрезав пуповину, а затем обрежьте дополнительные эмбриональные ткани как можно больше, не повреждая эмбрионы.
Под рассеченным микроскопом с помощью волоконно-оптического микроскопа иллюминатор отрежьте голову эмбриона и перенесите его в 1,5 миллилитровую трубку со 100 микролитров буфера А для более поздних генотипирования, чтобы соотнести с результатами эпифлуоресцентной визуализации. Используя тонкие миппы, откройте грудную клетку эмбриона. Острыми хирургическими ножницами и типсами удалите сердце из легких и сосудов.
Используйте пинцет для переноса расчлененного эмбрионального сердца в 35-миллиметровую культурную пластину с ПОМОЩЬю PBS. Поместите пластину с эмбриональными сердцами мыши под эпифлюоресцентным рассечением микроскопа. Используйте тонкие миппы, чтобы распоставить эмбриональные сердца таким образом, чтобы развивающие желудочков сталкиваются с экспертом.
Отрегулируйте фокус с помощью 0,63-х объектива в режиме яркого поля. Возьмите ярко-полевых экспозиций и захватить несколько изображений. Чтобы визуализировать экспрессию tdTomato, выключите микроскоп и установите фильтр для красной флуоресценции.
При необходимости отрегулируйте фокусировку изображения, отрегулируйте яркость и контрастность, сделайте краснофлуоресцентные экспозиции и захватите несколько изображений. Для генотипирования эмбрионов кипячение ранее изолированных образцов головы в буфере А при 100 градусах Цельсия в течение 30 минут. Центрифуга в течение двух минут в 11, 360 раз G.Transfer 20 микролитров супернатанта в новую 1,5 миллилитровую трубку с 20 микролитров буфера B и смеси.
Используйте 4,5 микролитера смешанного супернатанта в качестве шаблона ДНК и объедините его с 0,5 микролитров каждого из 10 микромолярно-специфических форвардов и реверсивных грунтовок, 10 микролитров полимеразы и буфера реакции 2x-premixed, а затем добавьте воду в общий объем 20 микролитров. Запустите ПЦР, как описано в рукописи. Загрузите завершенную реакцию в 100 базовой паре ДНК лестницы на 1%agarose гель и запустить на 140 вольт в 1x TAE буфера в течение 25 минут.
Поместите завершенный гель на УФ-трансиллюминатор и включите ультрафиолетовый свет для идентификации полос ДНК. MLC-2v считается самым ранним маркером для желудочковой камеры спецификации во время развития сердца. В MLC-2v-tdTomato репортер стук в мышей, относительно слабое выражение tdTomato в линейной трубке сердца на E8.0 становится сильнее на E8.5, как показано с помощью цельно-монтировать эпифлурелсцентные изображения эмбрионов.
Используя цельно-монтирующий эпифлурелсцентное изображение расчлененного сердца, образование желудочковой камеры во время развития сердца мыши можно легко определить. В расчлененном сердце от целого эмбриона мыши на E10.5, MLC-2v-tdTomato выражение репортера было показано в желудочковой части сердца, а не в тракте притока, отток тракта, или будущее atria. На E12.5 до E13.5, tdTomato репортер исключительно выражается в желудочках четырехколесного сердца.
Аналогичная модель экспрессии желудочков была показана в расчлененном эмбрионе мыши на E16.5. После целой визуализации генотип эмбрионов был определен с использованием двух наборов грунтовок для генотипирования ПЦР, подтверждающих гомозиготные эмбрионы, несущие аллель tdTomato knock-in, гетерозигот и эмбрионы дикого типа. Этот метод довольно прост и прост в работе.
Критическим шагом является вскрытие эмбриональных сердец. Понимание сердечной анатомии во время развития сердца необходимо для успешной изоляции сердца от всего эмбриона.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены протоколы для исследования развития сердца мыши с использованием полной монтажной эпифлуоресцентной микроскопии на мышачных линиях с генным отчётом MLC-2v-tdTomato. Метод позволяет непосредственно наблюдать стадии формирования желудочков без использования сложных гистохимических методов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Девелопментальная биология
- Кардиоваскулярные исследования
Фон
- Развитие сердца является критической областью исследований в девелопментальной биологии.
- Традиционные методы исследования морфологии сердца могут быть трудоемкими.
- Мыши с флуоресцентными отчетами предлагают новый подход к визуализации структур сердца.
- Мыши MLC-2v-tdTomato служат полезной моделью для этих исследований.
Цель исследования
- Предоставить простой метод для визуализации стадий развития сердца.
- Демонстрировать полезность мышей с флуоресцентными отчетами в девелопментальных исследованиях.
- Облегчить исследования без необходимости использования сложных методов.
Используемые методы
- Полная монтажная эпифлуоресцентная микроскопия.
- Использование мышей с генным отчётом MLC-2v-tdTomato.
- Диссекция эмбрионов на разных стадиях развития.
- Простая экспериментальная установка, подходящая для обычных лабораторных условий.
Основные результаты
- Успешная визуализация формирования сердечной трубки и её искривления.
- Четкое наблюдение формирования полных камер.
- Метод применим к другим линиям мышей с флуоресцентным отчётом.
- Протокол продемонстрировал простоту использования в стандартных лабораторных условиях.
Выводы
- Представленный метод упрощает исследование развития сердца.
- Он позволяет исследователям визуализировать критические стадии без сложных процедур.
- Этот подход может улучшить понимание кардиогенеза.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
