8,231 Views
•
09:45 min
•
May 21, 2019
DOI:
Для доступа к нейронной микроРНК целевых взаимодействий с функциями MicroRNA имеет решающее значение для понимания того, как микроРНК регулируют различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных состояниях. Этот протокол описывает воспроизведение с помощью стратегии определения целей микроРНК и функциональных микроРНК, поскольку проверка прямой цели микроРНК является сложной задачей. Наш протокол может дать представление о функции отдельных микроРНК и последствиях микроРНК в терапии рака.
Расчет полу максималлионной ингибирующей концентрации является важным методом не только для исследований микроРНК, но и для эффективной оценки других противоопухолевых препаратов. Наш протокол будет полезен для новых исследователей, так как мы описали фундаментальный метод, чтобы понять уровень микроРНК в клетке. Чтобы начать протокол, подсчитайте ячейки с счетчиком ячейки.
Плита клеток в 96 хорошо пластины. На следующий день, подготовить набор трансфекции смесей для трансфекции клеток в нескольких окончательных концентрациях микроРНК контроля имитировать, и микроРНК-107 имитировать. Из запаса 25 микромолярной микроРНК контроль имитирует, или микроРНК-107 имитировать, разбавлять и добавлять контроль имитировать или микроРНК-107 имитировать в уменьшенных средств сыворотки вместе с трансфекции реагент в микроцентрифуг труб.
Аккуратно смешайте олигосодержащие смеси с помощью микропипетта. После 10-минутной инкубации в капюшоне клеточной культуры, аккуратно смешайте олигосодержащие смеси снова, а затем добавьте 50 микролитров смесей в каждый колодец. Храните трансфицированные клетки в инкубаторе клеточной культуры.
Тщательно аспирировать клеточной культуры средств массовой информации в каждом хорошо пластины и быстро заполнить 100 микролитров 10% трихлороацетической кислоты, или TCA, в каждый колодец. Держите пластину, содержащую 10%TCA при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем несколько раз вымойте тарелку, погрузив ее в ванну с водопроводной водой.
Удалите излишки воды изнутри колодцев, постукивая пластины, пока не осталось воды, и высушить пластину. Pipette 50 микролитров 0,4% SRB раствор в каждой скважине, включая пустые скважины. Аккуратно встряхните пластину до тех пор, пока раствор 0.4%SRB равномерно не покрывает дно скважин.
Затем инкубировать пластину в течение 40 до 60 минут. После инкубации вымойте тарелку 1%-ацетической кислотой до тех пор, пока не будет полностью смыт неприсохленный краситель. Pipette 100 микролитров 10 миллимолярный tris базовый раствор в соответствующие скважины, в том числе пустые скважины.
Держите тарелку на шейкере в течение 10 минут. Измерьте абсорбанс на 492 нанометров. Рассчитайте процент среднего абсорбанса и стандартное отклонение каждой группы с использованием значений абсорбтности анализа SRB.
Импорт необработанных данных, включая концентрацию обработки, среднее поглощение и стандартное отклонение в программное обеспечение путем вертикального выравнивания данных. Нажмите на вкладку «Создать график» и выберите простые бары ошибок рассеяния. Выберите столбцы листа в качестве значений символов и нажмите далее.
В панели формата данных выберите пары X-Y и нажмите далее. Выберите соответствующие столбцы данных в панели Select Data. Нажмите закончить, чтобы создать сюжет.
Дважды нажмите на X-ось, чтобы изменить тип шкалы в масштабировании оси. Измените тип шкалы от линейного к журналу. Измените число стартовых и конечных диапазонов до 0,01 и 200 соответственно.
Нажмите правой кнопкой мыши на любой участок рассеяния, выберите Curve Fit и перейдите в подкатегорию Пользователь Defined. Выберите кривую реакции дозы. Нажмите на следующие кнопки, а затем нажмите закончить.
Перейдите на вкладку отчета, а затем проверьте значения n, k и R. Запустите ПЦР, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем перейти к двойному пищеварению путем объединения реакционных смесей, в том числе ограничения ферментов Exo1 и Not1 один в трубке.
Инкубировать смеси в течение трех-четырех часов в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Вы запустите двух перевариваемые продукты на 1%agarose гель. Затем вырежьте полосы под ультрафиолетовым светом.
Очистить двухразовые продукты ПЦР и люциферазы из выкакциоровок. Продолжить перевязку продуктов ПЦР в векторы люциферазы, подготовив 20 микролитров перевязонной реакционной смеси, включая ДНК-лигазу. Кратко центрифуга трубки в течение 10 до 15 секунд.
Инкубировать перевязку при 16 градусах по Цельсию на ночь с помощью теплового цикла. На следующий день, выполнить преобразование путем добавления перевязочные смеси в трубку, содержащую компетентные клетки. Аккуратно коснитесь трубки и держите ее на льду в течение 20 минут.
Быстро и осторожно перенесите трубку в тепловой блок при температуре 42 градуса по Цельсию в течение 30 секунд до одной минуты. После теплового удара поместите трубку на лед на 20 минут. Распространение компетентных клеток на пластине LB агар.
Выращиваем компетентные клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия за одну ночь. На следующий день, выбрать индивидуальную колонию и повторно E.coli в одной из 8-полосных труб, содержащих ультрапурную воду, и повторить этот шаг, чтобы повторно E.coli от четырех до восьми случайно выбранных колоний. Перенесите 25 микролитров подвески E.coli в другой набор 8-полосных трубок.
Выполните колонию PCR с помощью подвески E.coli. Подготовка анализа люциферазы в 24 хорошо пластины. Добавьте один-два раза десять к четырем клеткам в 500 микролитровых клеточных средствах массовой информации для каждого хорошо.
После ночной инкубации, трансфект 50 нанограммов векторов люциферазы в клетки с контролем имитировать или конкретной микроРНК имитировать с помощью трансфектного реагента. На следующий день, мыть внутри скважин в два раза с помощью фосфата буфера солевого раствора. Нанесите 200 микролитров реагента лиза в скважины и достаточно провести клеточный лиз перед измерением активности люциферазы.
Держите тарелку встряхивания, по крайней мере 15 минут. Перенесите от пяти до 10 микролитров лизайта клетки в новую трубку, добавьте 100 микролитров реагента один и сразу же смешайте раствор с помощью труб. Затем прочитайте активность светлячка люциферазы с помощью иллюминометра в течение 10-15 секунд.
Добавьте 100 микролитров реагента два в одной трубке, а затем смешайте трубчатые дважды. Наконец, прочитайте активность renilla luciferase в течение 10-15 секунд с помощью иллюминометра. RTPCR показывает значительное сокращение микроРНК-107 и PANC-1 и CAPAN-1 клеток по сравнению с клетками HPNE.
Уровни микроРНК-301 были значительно выше регулируется в клетках PANC-1 и CAPAN-1, по сравнению с клетками HPNE. Анализ SRB в этом исследовании ясно показывает, что пролиферация клеток PANC-1 снизилась после микроРНК-107 имитировать трансфекцию. Скрининг 11 потенциальных прогнозируемых целей микроРНК-107 ясно показывает, что только синуклеин гамма, или SNCG, положительный регулятор роста опухолевых клеток непосредственно взаимодействует с микроРНК-107 и клетками PANC-1, что указывает на то, что микроРНК-107 может негативно регулировать распространение клеток PANC-1, модулируя экспрессию SNCG.
Взрослые клетки пролиферации анализы, которые используют тетра гидролея основе лица и CFSE применимы для проверки эффекта, такие как микроРНК имитирует, в зависимости от типов клеток. На основе экспериментально проверенной функции микроРНК требуется систематический обзор базы данных и программы целевого прогнозирования для сужения списка целей кандидатов до анализа люциферазы. Для оценки комбинированной эффективности микроРНК с противооскитными препаратами выгодно рассчитать скорректированные значения ИК на основе нашего протокола оценки комбинированного индекса.
Этот протокол использует зонд на основе в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (PCR), сульфорходамин B (SRB) обзор, 3'непереведенных регионов (3' UTR) клонирования, и luciferase обзор для проверки целевых генов miRNA интереса и понять функции miRNAs.
11:00
Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs
Видео по теме
13671 Views
08:12
Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer
Видео по теме
5395 Views
08:30
MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)
Видео по теме
24434 Views
00:07
In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice
Видео по теме
7200 Views
11:44
Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Видео по теме
7523 Views
08:36
In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction
Видео по теме
7448 Views
16:24
Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells
Видео по теме
20048 Views
11:29
miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues
Видео по теме
10782 Views
06:01
Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization
Видео по теме
6701 Views
08:40
Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library
Видео по теме
17526 Views
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).
Copy