Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

Для доступа к нейронной микроРНК целевых взаимодействий с функциями MicroRNA имеет решающее значение для понимания того, как микроРНК регулируют различные биологические процессы как в здоровых, так и в больных состояниях. Этот протокол описывает воспроизведение с помощью стратегии определения целей микроРНК и функциональных микроРНК, поскольку проверка прямой цели микроРНК является сложной задачей. Наш протокол может дать представление о функции отдельных микроРНК и последствиях микроРНК в терапии рака.

Расчет полу максималлионной ингибирующей концентрации является важным методом не только для исследований микроРНК, но и для эффективной оценки других противоопухолевых препаратов. Наш протокол будет полезен для новых исследователей, так как мы описали фундаментальный метод, чтобы понять уровень микроРНК в клетке. Чтобы начать протокол, подсчитайте ячейки с счетчиком ячейки.

Плита клеток в 96 хорошо пластины. На следующий день, подготовить набор трансфекции смесей для трансфекции клеток в нескольких окончательных концентрациях микроРНК контроля имитировать, и микроРНК-107 имитировать. Из запаса 25 микромолярной микроРНК контроль имитирует, или микроРНК-107 имитировать, разбавлять и добавлять контроль имитировать или микроРНК-107 имитировать в уменьшенных средств сыворотки вместе с трансфекции реагент в микроцентрифуг труб.

Аккуратно смешайте олигосодержащие смеси с помощью микропипетта. После 10-минутной инкубации в капюшоне клеточной культуры, аккуратно смешайте олигосодержащие смеси снова, а затем добавьте 50 микролитров смесей в каждый колодец. Храните трансфицированные клетки в инкубаторе клеточной культуры.

Тщательно аспирировать клеточной культуры средств массовой информации в каждом хорошо пластины и быстро заполнить 100 микролитров 10% трихлороацетической кислоты, или TCA, в каждый колодец. Держите пластину, содержащую 10%TCA при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем несколько раз вымойте тарелку, погрузив ее в ванну с водопроводной водой.

Удалите излишки воды изнутри колодцев, постукивая пластины, пока не осталось воды, и высушить пластину. Pipette 50 микролитров 0,4% SRB раствор в каждой скважине, включая пустые скважины. Аккуратно встряхните пластину до тех пор, пока раствор 0.4%SRB равномерно не покрывает дно скважин.

Затем инкубировать пластину в течение 40 до 60 минут. После инкубации вымойте тарелку 1%-ацетической кислотой до тех пор, пока не будет полностью смыт неприсохленный краситель. Pipette 100 микролитров 10 миллимолярный tris базовый раствор в соответствующие скважины, в том числе пустые скважины.

Держите тарелку на шейкере в течение 10 минут. Измерьте абсорбанс на 492 нанометров. Рассчитайте процент среднего абсорбанса и стандартное отклонение каждой группы с использованием значений абсорбтности анализа SRB.

Импорт необработанных данных, включая концентрацию обработки, среднее поглощение и стандартное отклонение в программное обеспечение путем вертикального выравнивания данных. Нажмите на вкладку «Создать график» и выберите простые бары ошибок рассеяния. Выберите столбцы листа в качестве значений символов и нажмите далее.

В панели формата данных выберите пары X-Y и нажмите далее. Выберите соответствующие столбцы данных в панели Select Data. Нажмите закончить, чтобы создать сюжет.

Дважды нажмите на X-ось, чтобы изменить тип шкалы в масштабировании оси. Измените тип шкалы от линейного к журналу. Измените число стартовых и конечных диапазонов до 0,01 и 200 соответственно.

Нажмите правой кнопкой мыши на любой участок рассеяния, выберите Curve Fit и перейдите в подкатегорию Пользователь Defined. Выберите кривую реакции дозы. Нажмите на следующие кнопки, а затем нажмите закончить.

Перейдите на вкладку отчета, а затем проверьте значения n, k и R. Запустите ПЦР, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем перейти к двойному пищеварению путем объединения реакционных смесей, в том числе ограничения ферментов Exo1 и Not1 один в трубке.

Инкубировать смеси в течение трех-четырех часов в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Вы запустите двух перевариваемые продукты на 1%agarose гель. Затем вырежьте полосы под ультрафиолетовым светом.

Очистить двухразовые продукты ПЦР и люциферазы из выкакциоровок. Продолжить перевязку продуктов ПЦР в векторы люциферазы, подготовив 20 микролитров перевязонной реакционной смеси, включая ДНК-лигазу. Кратко центрифуга трубки в течение 10 до 15 секунд.

Инкубировать перевязку при 16 градусах по Цельсию на ночь с помощью теплового цикла. На следующий день, выполнить преобразование путем добавления перевязочные смеси в трубку, содержащую компетентные клетки. Аккуратно коснитесь трубки и держите ее на льду в течение 20 минут.

Быстро и осторожно перенесите трубку в тепловой блок при температуре 42 градуса по Цельсию в течение 30 секунд до одной минуты. После теплового удара поместите трубку на лед на 20 минут. Распространение компетентных клеток на пластине LB агар.

Выращиваем компетентные клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия за одну ночь. На следующий день, выбрать индивидуальную колонию и повторно E.coli в одной из 8-полосных труб, содержащих ультрапурную воду, и повторить этот шаг, чтобы повторно E.coli от четырех до восьми случайно выбранных колоний. Перенесите 25 микролитров подвески E.coli в другой набор 8-полосных трубок.

Выполните колонию PCR с помощью подвески E.coli. Подготовка анализа люциферазы в 24 хорошо пластины. Добавьте один-два раза десять к четырем клеткам в 500 микролитровых клеточных средствах массовой информации для каждого хорошо.

После ночной инкубации, трансфект 50 нанограммов векторов люциферазы в клетки с контролем имитировать или конкретной микроРНК имитировать с помощью трансфектного реагента. На следующий день, мыть внутри скважин в два раза с помощью фосфата буфера солевого раствора. Нанесите 200 микролитров реагента лиза в скважины и достаточно провести клеточный лиз перед измерением активности люциферазы.

Держите тарелку встряхивания, по крайней мере 15 минут. Перенесите от пяти до 10 микролитров лизайта клетки в новую трубку, добавьте 100 микролитров реагента один и сразу же смешайте раствор с помощью труб. Затем прочитайте активность светлячка люциферазы с помощью иллюминометра в течение 10-15 секунд.

Добавьте 100 микролитров реагента два в одной трубке, а затем смешайте трубчатые дважды. Наконец, прочитайте активность renilla luciferase в течение 10-15 секунд с помощью иллюминометра. RTPCR показывает значительное сокращение микроРНК-107 и PANC-1 и CAPAN-1 клеток по сравнению с клетками HPNE.

Уровни микроРНК-301 были значительно выше регулируется в клетках PANC-1 и CAPAN-1, по сравнению с клетками HPNE. Анализ SRB в этом исследовании ясно показывает, что пролиферация клеток PANC-1 снизилась после микроРНК-107 имитировать трансфекцию. Скрининг 11 потенциальных прогнозируемых целей микроРНК-107 ясно показывает, что только синуклеин гамма, или SNCG, положительный регулятор роста опухолевых клеток непосредственно взаимодействует с микроРНК-107 и клетками PANC-1, что указывает на то, что микроРНК-107 может негативно регулировать распространение клеток PANC-1, модулируя экспрессию SNCG.

Взрослые клетки пролиферации анализы, которые используют тетра гидролея основе лица и CFSE применимы для проверки эффекта, такие как микроРНК имитирует, в зависимости от типов клеток. На основе экспериментально проверенной функции микроРНК требуется систематический обзор базы данных и программы целевого прогнозирования для сужения списка целей кандидатов до анализа люциферазы. Для оценки комбинированной эффективности микроРНК с противооскитными препаратами выгодно рассчитать скорректированные значения ИК на основе нашего протокола оценки комбинированного индекса.