ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC50 Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов

Анализы активности на основе ЯМР обеспечивают эффективный метод выявления, оценки и проверки ингибиторов данного фермента. Они особенно хорошо подходят для скрининга фрагментов. Анализы ЯМР податрены для более высоких концентраций соединений, необходимых для более слабых ингибиторов.

Кроме того, отсутствие ферментов репортера делает их менее склонными к ложным срабатываниям. Мы используем nmR анализы в нашей лаборатории, чтобы определить и охарактеризовать ингибиторы двух ферментов из Trichomonas vaginalis. Оба фермента представляют собой новые мишени для новых антитрихомональных препаратов.

Анализы ЯМР, как правило, применимы к любой области исследований, которая включает в себя ферменты, и они даже могут быть использованы для изучения ферментов внутри клеток. Наиболее важными аспектами метода являются обеспечение того, чтобы правильные объемы реагентов были трубными и компоненты реакции тщательно перемешаны. Для подготовки субстрата и испытательных соединений добавьте 12 микролитров субстрата к каждому из четырех 1,5-миллилитровых микрофьюдж-трубок и добавьте шесть микролитров дейтерированных DMSO к нулевому минутному контролю и 30-минутным контрольным трубкам.

Добавьте шесть микролитров испытательного соединения к первой экспериментальной трубке и три микролитера испытательного соединения и три микролитров дейтетерированного DMSO во вторую экспериментальную трубку. Затем добавьте 300 микролитров оксида дейтерия в 15-миллилитровую трубку, содержащую 2,59 миллилитров буфера реакции, а затем 25 микролитров ферментного раствора. Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать раствор реакции и добавить 10 микролитров 1,5 молярной соляной кислоты в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 582 микролитров раствора реакционной массы.

Затем перенесите весь объем раствора реакции и кислоты в контрольную трубку с нулевой минутой, чтобы одновременно инициировать и утолить нулевую реакцию управления. Аспирация и распределение образца два раза в медленной, но преднамеренной манере. Инициировать и запустить оставшиеся три реакции в шахматном порядке, сразу же передачи 582 микролитров реакции фондового решения в первую экспериментальную трубку и смешивания образца в два раза, как только что продемонстрировано.

Тщательное стремление и распределение обеспечивает полное смешивание во время этапов посвящения. Будьте в соответствии с каждой выборкой, чтобы обеспечить дифференциальное смешивание не является переменной. Через 30 секунд перенесите 582 микролитров раствора реакционной штока во вторую экспериментальную трубку и смешайте, а затем добавление еще 582 микролитров раствора реакционной штока в 30-минутную контрольную трубку через 30 секунд после начала реакции во второй экспериментальной трубке.

Через 30 минут добавьте 10 микролитров 1,5-молярной соляной кислоты в первую экспериментальную трубку, повторяя затухание с 30-секундными интервалами для второй экспериментальной и 30-минутной контрольных трубок. Когда все реакции будут утоляются, перенесите 600 микролитров раствора из каждой реакции в трубки ЯМР. Чтобы вычислить процентное преобразование субстрата для контрольных спектров, загрузите образцы на спектрометр, соберите спектры ЯМР и наложить спектры на нулевой и 30-минутный элементы управления.

Масштабировать сигнал субстрата в нулевой минуте управления, чтобы соответствовать 30-минутный контроль и отметить этот процент. Затем вычислите процентное преобразование как 100 минус процент от сопоставления сигналов субстрата. Чтобы рассчитать процентное преобразование субстрата для реакций, содержащих испытательное соединение, наложить спектры на контроль нулевой минуты и первую реакцию, содержащую 500-микромолярновое испытательное соединение, и масштабировать сигнал субстрата в нулевом минутном контроле, чтобы соответствовать спектру с тестовым соединением.

Обратите внимание на этот процент и используйте его для расчета процентной конверсии, как это было продемонстрировано. Затем наложить спектры на контроль нулевой минуты и первую реакцию, содержащую 250-микромолярное испытательное соединение, и масштабировать сигнал субстрата в нулевом минутном контроле, чтобы соответствовать спектру с тестовым соединением. После того, как выявив процент, используйте его для расчета процентной конверсии.

Чтобы вычислить процентную реакцию и процентное торможение для каждой концентрации соединения теста, во-первых, вычислить процент реакции, как процентное преобразование тестового соединения, разделенного на процент преобразования времени управления 100. Затем рассчитайте процентное торможение как 100 минус процентная реакция. Для выполнения анализа счетчика моющего средства добавьте 300 микролитров оксида дейтерия и 25 микролитров ферментного раствора в 15-миллилитровую трубку, содержащую 2,59 миллилитров буфера реакции.

Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать раствор реакции фонда, и добавить два микролитров triton X-100 моющего средства до 20 миллилитров реакции буфера. Затем добавьте 2,59 миллилитров буфера реакции, содержащего 0,01%Triton X-100 моющее средство в новую 15-миллилитровую коническую трубку. Затем добавьте в трубку 300 микролитров оксида дейтерия и 25 микролитров ферментного раствора.

Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать реакционной фондовой раствор. Затем определите процентное ингибирование 100-микромолярных и 50-микромоляных тестовых соединений, как это было продемонстрировано. Использование раствора запаса реакции без моющего средства, для одного набора из четырех трубок и раствора запаса реакции с моющим средством для второго набора из четырех трубок.

Для выполнения скачко-разбавления перенесите 468 микролитров буфера реакции и 60 микролитров оксида дейтерия в трубку, содержащую 53,8 микролитров буфера реакции, пять микролитров ферментного раствора и 1,2 микролитров DMSO, которые инкубируют в течение 30 минут. Аспирировать и распределять смесь два раза в медленной, но преднамеренной манере. Перед передачей 468 микролитров буфера реакции и 60 микролитров оксида дейтерия в трубку, содержащую 53,8 микролитров буфера реакции, пять микролитров ферментного раствора и 1,2 микролитера испытательного соединения, которые инкубируют в течение 30 минут.

Смешайте вторую реакцию два раза, как попродемонстрировано. И сразу же перенесите 588 микролитров раствора из трубки управления ДМСО для скачок в трубку, содержащую 12 микролитров субстрата со смешиванием. Продолжить передачу 588 микролитров из прыжка разбавления пробной трубки, неразбавленной DMSO трубки управления, и неразбавленный пробирки соединения трубки для каждого из трех 1,5-миллилитровых труб, содержащих 12 микролитров субстрата на трубку с смешиванием с 30-секундными интервалами после этого.

Затем подождите 30 минут, прежде чем утолить реакции, собирая спектры ЯМР и вычисляя процентное торможение для каждого соединения, как только что продемонстрировано. Здесь показаны результаты тестирования двух соединений против AgNH в первоначальном тестовом анализе соединения с использованием протонной ЯМР, как показано на фото. Ферментная реакция наиболее легко наблюдается и количественно по исчезновению аденозина синглет и дублет резонансов на 8,48 и 6,09 частей на миллион соответственно.

И появление аденин синглетного места жительства на 8,33 частей на миллион, как это наблюдается в 30-минутном контрольном спектре. На этом рисунке показаны результаты тестирования соединения в двух концентрациях против AgNH в анализе счетчика моющих средств с использованием протонной ЯМР, как показано на рисунке. Только минимальные различия наблюдаются в интенсивности субстрата и сигналов продукта, используя эти два условия, что указывает на то, что наблюдаемое ингибирование ферментов не является артефактом агрегации соединения.

Обратите внимание, что резонансы, возникающие в результате испытания соединения и моющего средства, не мешают субстрату или резонансам продукта. Результаты тестирования соединения в скачок разбавления анализ против AGNH с использованием протонного ЯМР, как попродемонстрировано выявить снижение интенсивности сигнала субстрата в 20-микромолянной реакции по сравнению с 200-микромолянной реакции, что свидетельствует о том, что ингибирование обратимо. Полный образец смешивания во время начала каждой реакции и для скачка разбавления имеет решающее значение.

Требуется тщательное и последовательное стремление и распределение. Анализы на основе ЯМР также могут быть использованы для измерения активности ферментов в целых клетках, используя раствор, содержащий подвесные клетки вместо буфера реакции и фермента. Наши усилия по открытию антитрихомональных препаратов продолжают полагаться на эти анализы для измерения потенции вновь синтезированных соединений против ферментов рибогидролаза.

Несмотря на то, что она используется только в очень небольших количествах, соляная кислота, используемая для утоления реакций, опасна и должна использоваться с надлежащим защитным оборудованием.