Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ реализации микроскопии с визуализацией времени жизни флуоресценции с временным гейтированием (FLIM) в автоматизированном рабочем процессе с использованием многолуночных планшетов, программного обеспечения с открытым исходным кодом и базового оборудования. Данная методология может быть применена для считывания данных на основе FLIM в сериях фиксированных или живых клеток. Она особенно полезна для анализа обработки клеточных сигналов или белковых взаимодействий.

Основными преимуществами данного метода являются то, что FLIM обеспечивает надежные количественные показатели и позволяет определить долю взаимодействующей популяции за одно измерение. Применение методов глобального анализа к тысячам клеток на сотнях полей зрения позволяет использовать показатели фёрстерского резонансного переноса энергии (FRET), учитывая, например, изменения времени жизни вплоть до 20 ps.

Процедуру с Фредериком Гёрлитцем продемонстрируют Сунил Кумар, наш научный сотрудник, и Иан Манро, наш разработчик программного обеспечения. Начните с запуска MicroManager и откройте плагин openFLIM-HCA. На вкладке управления FLIM выберите файл калибровки окна задержки (delay box calibration file) и откройте калибровочные файлы.

Выберите калибровочный файл для конкретной комбинации блока генератора задержки и интересующей вас частоты повторения лазера. В меню «File» выберите «Set base folder» и укажите папку, в которой будут сохраняться данные. После подтверждения правильности всех установленных параметров вручную установите ширину окна регистрации 4 нс на панели управления вентилируемым оптическим усилителем для всего эксперимента.

Для получения данных изображения функции отклика прибора вручную поместите блокиратор луча в кассету с фильтр-кубом перед объективом, чтобы предотвратить выход лазерного излучения, и наклоните блокиратор так, чтобы минимизировать любое отражение обратно в раму микроскопа. На вкладке управления световым путем настройте возбуждающий, дихроичный и эмиссионный фильтры в блоке с вращающимся диском таким образом, чтобы часть возбуждающего света, рассеянного вращающимся диском Нипкова, могла быть зафиксирована без насыщения системы при минимальном времени интеграции камеры 200 milliseconds. На вкладке управления FLIM используйте функцию поиска максимальной точки (find max point) во всем диапазоне задержек, обеспечиваемых программируемым блоком быстрого изменения задержки.

Затем проверьте отображаемую трассу сигнала. Установите время задержки курса таким образом, чтобы полный профиль функции инструментального отклика находился в пределах диапазона сканирования блока быстрой задержки. Отрегулируйте параметры нейтральной плотности и времени экспозиции.

Также следует настроить накопление кадров таким образом, чтобы камера не достигала насыщения в интервале яркости, а эффективное время интегрирования составляло не менее 200 миллисекунд. В меню управления FLIM выберите «fast delay box» и установите шаг задержки 25 пикосекунд по всему диапазону задержки. Затем выберите «populate delays» и нажмите «snap FLIM image» для получения изображения функции приборного отклика.

Дождитесь завершения сбора данных. В меню управления световым путем выберите «neutral density» и нажмите «blocked», чтобы заблокировать лазер. Откройте меню управления FLIM и выберите «fast delay box», чтобы уменьшить количество шагов задержки, увеличив значение в поле «increment».

Затем нажмите кнопку «snap FLIM image» для получения фонового изображения с камеры. Для получения эталонных данных о красителе перейдите на вкладку управления XYZ и введите H4 в диалоговом окне выбора лунки. Далее перейдите на вкладку управления световым путем и выберите соответствующие возбуждающий, дихроичный и эмиссионный фильтры для визуализации флуоресцентного белка M turquoise, используя функцию «find max point» во всем диапазоне окна быстрого затвора (fast delay box).

Затем установите соответствующие параметры для получения данных эталонного красителя и соответствующего фонового изображения, как было показано выше. Для получения данных FLIM из образца в многолуночной планшетке перейдите в меню настройки последовательного сбора данных HCA. Выберите вкладку позиций XYZ и укажите, какие лунки необходимо визуализировать, а также количество полей зрения, которые следует получить для каждой лунки.

Выберите репрезентативное поле зрения, содержащее образец для визуализации, и установите оптимальный фильтр нейтральной плотности в параметрах времени интегрирования камеры, чтобы достичь 75% динамического диапазона считывающей камеры. На вкладке управления XYZ в диалоговом окне автофокуса выберите функцию возврата управления фокусом и вручную сфокусируйте микроскоп на интересующих клетках или структурах. Установите диапазон поиска автофокуса на 2000 micrometers и нажмите enter.

Затем нажмите AF now для запуска процедуры автоматической фокусировки. В поле focus offset auto focus появится значение смещения. Введите это значение в окно AF offset и дважды нажмите AF now, чтобы повторить процедуру автоматической фокусировки.

Теперь значения смещения должны быть установлены на ноль, что указывает на правильную работу системы автоматической фокусировки. Далее во вкладке управления FLIM выберите функцию автогейтинга (autogating) для обеспечения логарифмической выборки точек задержки. Установите количество кадров накопления (accumulate frames) на значение, которое обеспечит желаемое общее время сбора данных.

Затем в диалоговом окне сбора данных FLIM нажмите кнопку запуска последовательности HCA, чтобы начать сбор данных FLIM для многолуночного планшета и получить фоновое изображение с камеры, как было продемонстрировано ранее. Здесь представлен репрезентативный анализ FLIM-FRET с использованием модельной системы FRET, экспрессированной в ко-клетках, и многолуночного планшета, с примерами автоматически полученных изображений времени жизни флуоресценции типичных полей зрения в каждой лунке. В данном эксперименте в лунках с отрицательным контролем наблюдалось самое длительное время жизни, а самое короткое время жизни донора было зафиксировано для FRET-конструктов с наиболее короткими линкерами.

В целом, среднее время жизни, усредненное по всем полям зрения в каждой лунке, варьировалось между многолуночными планшетами. Усреднение профиля затухания интенсивности флуоресценции донора по всем клеткам, визуализированным в лунке A1, вместе с аппроксимацией моделью моноэкспоненциального затухания и функцией прибора, иллюстрирует применимость данной модели. Дальнейший анализ среднего времени жизни флуоресценции для каждого столбца многолуночного планшета, полученный с помощью попиксельной моноэкспоненциальной аппроксимации, демонстрирует, что время жизни сокращается в FRET-конструктах с более короткими длиной линкеров, что имитирует эксперимент с различной эффективностью FRET.

В данном эксперименте данные FLIM для FRET-анализа воздействия различных ингибиторов на олигомеризацию белков были аппроксимированы с помощью модели одноэкспоненциального затухания. Карта времени жизни флуоресценции для планшета иллюстрирует среднее время жизни для каждой лунки, усредненное по восьми полям зрения. Один небольшой набор, включающий визуализацию четырех полей зрения на лунку; при этом наш FLIM-анализ может быть завершен примерно за два с половиной часа, включая время на получение функции аппаратного отклика, данных эталонного красителя и проведение анализа в программе FLIM fit.

При проведении анализа FLIM важно не забывать регистрировать функцию приборного отклика и данные эталонного красителя вместе с соответствующими изображениями фона, чтобы иметь всю информацию, необходимую для анализа данных FLIM. С помощью нашего программного обеспечения с открытым исходным кодом FLIM fit также можно аппроксимировать эти данные более сложными моделями затухания, что, например, позволяет определить долю популяции FRET.

Наша технология FLIM HCA помогает исследователям в области разработки лекарственных препаратов проводить надежные измерения FRET. В будущем мы рассчитываем, что эта технология позволит измерять константы диссоциации в анализах на основе клеток. Мы надеемся, что данная видеостатья, а также информация в нашей Вики, помогут другим исследователям создать собственные установки FLIM HCA и применить их для FRET и других видов анализов.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасной, и при использовании такого оборудования всегда следует соблюдать меры предосторожности, например, обеспечивать экранирование всех лазерных лучей.