Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как реализовать флюоресцентную микроскопию с временным стробированием, или FLIM, в автоматизированном рабочем процессе многолуночных планшетов с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом и базовых инструментов. Эта методология может быть применена к считыванию на основе FLIM в серии фиксированных или активных клеток. И это особенно полезно для считывания обработки клеточного сигнала или белковых взаимодействий.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что FLIM обеспечивает надежные количественные показания и может обеспечить фракцию взаимодействия популяции за одно измерение. Применение методов глобального анализа к тысячам ячеек в сотнях полей зрения позволяет нам использовать передачу энергии смолы Фостера, или считывание FRET. И с помощью, например, изменения времени жизни примерно до 20 пикосекунд.

Вместе с Фредериком Горлицем эту процедуру продемонстрируют Сунил Кумар, наш научный сотрудник, и Ян Манро, разработчик программного обеспечения. Начните с запуска микроменеджера и откройте плагин openFLIM-HCA. На вкладке Управление FLIM выберите файл калибровки коробки задержки и откройте файлы калибровки.

Выберите файл калибровки для конкретной комбинации генератора задержки и интересующей частоты лазерного повторения. В меню файлов выберите пункт Установить базовую папку и выберите папку, в которую будут сохраняться данные. После подтверждения того, что все соответствующие параметры были установлены, вручную установите ширину затвора в четыре наносекунды на блоке управления стробированным оптическим усилителем на весь эксперимент.

Чтобы получить данные изображения функции отклика прибора, вручную поместите блок луча в кассету с фильтром перед объективом, чтобы предотвратить утечку лазерного света, и наклоните блок луча так, чтобы свести к минимуму любое отражение обратно в раму микроскопа. На вкладке «Управление световым путем» установите фильтры возбуждения, дихроии и излучения в блоке вращающегося диска таким образом, чтобы можно было визуализировать долю возбуждающего света, рассеянного от вращающегося диска Нипкова, без насыщения системы в течение как минимум 200 миллисекунд времени интеграции камеры. На вкладке Управление FLIM используйте функцию поиска максимальной точки во всем диапазоне задержек, охватываемых программируемым блоком быстрой задержки.

Затем проверьте отображаемую трассировку вывода. И установите время задержки курса таким образом, чтобы полный профиль функции отклика прибора находился в пределах диапазона сканирования окна быстрой задержки. Отрегулируйте плотность нейтрали и параметры времени экспозиции.

А также накопление кадра, чтобы камера не насыщалась яркостью временным стробом и эффективное время интегрирования было не менее 200 миллисекунд. В меню управления FLIM выберите поле быстрой задержки и установите шаг задержки 25 пикосекунд для всего диапазона задержки. Затем выберите «Заполнить задержки» и нажмите «Прикрепить изображение FLIM», чтобы получить изображение функции отклика прибора.

И дождаться, пока приобретение будет завершено. В меню управления световым путем выберите нейтральную плотность и нажмите блокированный, чтобы заблокировать лазер. Откройте меню управления FLIM и выберите поле быстрой задержки, чтобы уменьшить количество шагов задержки за счет увеличения значения в поле приращения.

Затем нажмите «Прикрепить FLIM-изображение», чтобы получить фоновое изображение с камеры. Чтобы получить данные опорного кристалла, перейдите на вкладку управления XYZ и введите скважину H4 в диалоговом окне перехода к скважине. Далее перейдите на вкладку управления световым путем и выберите соответствующие фильтры возбуждения, дихроии и излучения для визуализации флуоресцентного белка M бирюзового цвета с помощью функции поиска максимальной точки во всем диапазоне окна быстрой задержки.

Затем установите соответствующие параметры для получения исходных данных кристалла и соответствующего фонового изображения, как показано выше. Чтобы получить данные FLIM из образца с несколькими луночными планшетами, перейдите в меню настройки последовательного сбора данных HCA. Выберите вкладку «Позиции XYZ» и укажите, какие скважины должны быть визуализированы, а также количество полей обзора, которые должны быть получены для каждой скважины.

Выберите репрезентативное поле зрения, содержащее образец, который необходимо изобразить, и установите оптимальный фильтр нейтральной плотности во время интеграции камеры, чтобы достичь 75% динамического диапазона считывающей камеры. На вкладке «Управление XYZ» выберите «Возврат управления фокусом» в диалоговом окне автофокусировки и вручную сфокусируйте микроскоп на интересующих клетках или структурах. Установите диапазон поиска автоматической фокусировки на 2000 микрометров и нажмите Enter.

Затем нажмите AF now, чтобы запустить процедуру автофокусировки. Значение смещения появится в поле автофокусировки со смещением фокуса. Введите это значение смещения в окно смещения AF и дважды нажмите AF now, чтобы повторить процедуру автофокусировки.

Теперь значения смещения должны быть установлены в ноль, что указывает на правильную работу системы автоматической фокусировки. Затем на вкладке Управление FLIM выберите функцию автоматического стробирования, чтобы обеспечить логарифмическую выборку точек задержки. Задайте для параметра Накапливаемые кадры значение, которое дает желаемое общее время сбора данных.

Затем в диалоговом окне сбора данных FLIM нажмите кнопку «Начать последовательность HCA», чтобы запустить сбор данных с помощью многолуночного планшета FLIM и получить фоновое изображение с камеры, как показано выше. Здесь показан репрезентативный анализ FLIM на ладах с использованием модельной системы ладов, выраженной в коцеллах и многолуночной пластине, с примерами автоматически получаемых изображений времени жизни флуоресценции типичных полей зрения, видимых в каждой лунке. В этом эксперименте отрицательные контрольные лунки имели самое длительное время жизни, а донорские лунки показали самые низкие ладовые конструкции с наименьшей длиной линкера.

В целом, средний срок службы, усредненный по всем полям зрения в каждой скважине, варьировался по многолуночным планшетам. Усреднение профиля затухания интенсивности донорной флуоресценции по всем клеткам, визуализированным в лунке А1, вместе с подгонкой к моноэкспоненциальной модели распада и функцией отклика инструмента, показывает, что модель подгонки верна. Дальнейший анализ среднего времени жизни флуоресценции для каждой колонки многолуночной пластины, полученный из моноэкспоненциальной подгонки по пикселям, демонстрирует уменьшение времени жизни в конструкциях ладов при более короткой длине линкера, моделируя эксперимент с различной эффективностью ладов.

В этом эксперименте данные FLIM анализа действия различных ингибиторов на олигомеризацию белков были подобраны с одной моделью экспоненциального распада. Карта времени службы флуоресцентной пластины иллюстрирует среднее время жизни на скважину, усредненное по восьми полям зрения. Один небольшой набор, визуализирующий четыре поля зрения на лунку, в то время как наш анализ FLIM может быть завершен примерно за два с половиной часа, включая время на получение функции отклика инструмента, данных эталонного кристалла и проведение анализа в FLIM fit.

При выполнении анализа FLIM важно помнить о необходимости получения данных о функции отклика прибора и эталонных кристаллах вместе с их фоновыми изображениями, чтобы у вас была вся информация, необходимая для анализа данных FLIM. Используя наше программное обеспечение с открытым исходным кодом, FLIM fit, также можно вписать эти данные в более сложные модели распада. Например, позволяет определять долю населения ладов.

Наша технология FLIM HCA помогает исследователям в сообществе разработчиков лекарств проводить надежные измерения ладов. Мы надеемся, что в будущем эта технология позволит измерять константы диссоциации в клеточных анализах. Мы надеемся, что этот видеодокумент, а также информация в нашей Wiki помогут другим исследователям создать свои собственные инструменты FLIM HCA и применить их для ладов и других анализов.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасной, и что при использовании таких приборов всегда следует принимать меры предосторожности, такие как закрытие всех лазерных лучей.