Отображение структурно-функциональных отношений неупорядоченных онкогенных факторов транскрипции с использованием транскриптомного анализа

Выполнение анализа структурных функций повторяющихся и неупорядоченных факторов транскрипции является сложной задачей. Сочетая транскриптомику с правильным клеточным контекстом, этот подход лучше раскрывает важные структурно-функциональные взаимосвязи. Использование секвенирования РНК в качестве функционального результата позволяет эффективно оценить все гены, регулируемые одним белком, в одном эксперименте, что повышает вероятность обнаружения частичной функции.

Обнаружение частичной функции особенно важно для онкогенных факторов транскрипции слияния, поскольку мы не знаем, как функционируют эти белки, и их секвенирование может привести к лучшим методам лечения рака, вызванного слиянием. Хотя мы сосредоточимся на неупорядоченном домене EWS в EWS/FLI, EWS участвует в других слияниях, которые содержат неупорядоченные домены с плохо определенными функциями. Для трансдукции конструктов экспрессии кДНК сначала быстро разморозьте замороженный вирус с помощью конструкций кДНК на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и аккуратно смешайте 2,5 микролитра восьми миллиграммов на миллилитр полибрена в каждую мерзость.

Затем удалите среду из одной 50-70% сливающейся 10-сантиметровой клеточной культуральной пластины на каждую конструкцию флакона и аккуратно обойдите весь двухмиллилитровый объем конструкции вниз по боковой стороне пластины. Покачивайте планшет, чтобы вирус равномерно распределился по клеткам, и поместите планшет в инкубатор для культур тканей при температуре 37 градусов Цельсия на два часа, покачивая планшет каждые 30 минут, чтобы предотвратить высыхание любых участков планшета. В конце инкубации добавьте пять миллилитров среды, дополненной фетальной бычьей сывороткой, антибиотиками, пируватом натрия и полибреном.

После ночной инкубации в инкубаторе для клеточных культур замените надосадочную жидкость на среду для отбора и верните клетки в инкубатор для клеточных культур еще на 7-10 дней, чтобы обеспечить селекцию и экспрессию конструкции кДНК. В конце периода отбора соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для подсчета и распределите от пяти до 10 умножить на 10 на пятые клетки в новую пробирку для секвенирования РНК и два раза на 10 на шесть клеток в другую новую пробирку для экстракции белка. Отсадите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре холодной PBS или пятиминутном центрифугировании.

Затем мгновенно заморозьте гранулы и жидкий азот и храните элементы при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для валидации нокдауна представляющих интерес белков и экспрессии панели конструктов блоттинг образцов белкового лизата с соответствующими первичными и вторичными антителами в соответствии со стандартными протоколами вестерн-блот-анализа. Чтобы оценить качество и количество РНК, используйте буфер для лизиса из набора для экстракции на основе кремнеземной спиновой колонки для лизирования образцов клеток секвенирования РНК и нанесите лизаты на колонку для удаления геномной ДНК со скоростью более 13 000 оборотов в минуту в течение 30–60 секунд.

Далее приступаем к очистке кремнеземной спиновой колонки и промываем РНК на колонке в соответствии с инструкциями набора. Затем элюируйте РНК в 30 микролитрах элюирующего буфера и проанализируйте не менее 2,5 микрограммов РНК на спектрофотометре в соотношении от 260 до 280 нанометров, чтобы оценить количество РНК и качество образца. Для анализа файлов fastq используйте Putty, чтобы открыть терминал для высокопроизводительной вычислительной среды и создать каталог анализа с именем project.

Перейдите к пути к каталогу проекта и создайте каталог для сжатых файлов необработанных fastq. gz с именем fastq и второй каталог с именем trimmed. У нас есть подходящая безопасная программа передачи файлов для передачи сжатого необработанного fastq.

gz из локального хранилища в путь к директории проекта fastq и проверьте, что для каждого образца есть файл R1 и R2. Перейдите к пути к проекту fastq и используйте команду trim galore, как указано, чтобы обрезать низкое качество чтения из fastq. файлы gz.

Перейдите к пути к директории проекта и создайте новую директорию с именем STAR output. Перейдите к пути к директории trim проекта и используйте указанную команду для запуска STAR для выравнивания обрезанного fastq. файлы gz.

Найдите необходимые выходные данные для следующих шагов, которые содержат количество на транскриптов в указанном месте, и используйте команду для чтения каждого чтения на файл вкладки «Выход гена». Для первого столбца используйте только символы перед точкой в столбце идентификатора гена ENSEMBL для упрощения последующей обработки. Затем используйте команду для компиляции счетчиков всех выборок во фрейм данных, называемый totcts, и сохраните эту новую таблицу необработанных данных о количестве в виде текстового файла, разделенного табуляцией.

Чтобы определить профиль дифференциального выражения для каждой конструкции с помощью DESeq2, введите экспериментальную конструкцию DESeq2 и используйте матричную функцию набора данных DESeq для создания набора данных DESeq, оценки коэффициентов размера и запуска DESeq2. Чтобы оценить качество анализа, используйте DESeq2 для извлечения регуляризованных нормализованных счетчиков логарифмических данных. При извлечении результатов для каждого транскрипционного профиля из результатов DESeq2 выполните попарные сравнения с учетом либо условия нокдауна, либо базового пустого вектора.

Далее дополните эти результаты символами гена HGNC и извлеките данные из данных DESeq2 в виде одного файла с идентификатором гена ENSEMBL, символом HGNC, экспрессией baseMean и данными дифференциальной экспрессии для всех конструкций с логарифмическим двукратным изменением и исходными и скорректированными значениями P. Оцените успешную пакетную нормализацию и интересующее сходство выборки, а также используйте код для использования регуляризованных логарифмических нормализованных счетчиков для проверки кластеризации выборки с помощью анализа главных компонент и графиков расстояния между выборками. Используйте регуляризованный логарифмический нормализованный подсчет для извлечения 1000 наиболее вариабельных генов в матрицу и используйте тепловую карту для выполнения неконтролируемой иерархической кластеризации образцов на основе этих генов.

Чтобы извлечь интересующие кластеры из древовидной схемы, определите, на каком уровне дендрограммы появятся интересующие кластеры, и установите K равным числу кластеров на этом уровне. Чтобы определить, какие кластеры представляют интерес, перестройте тепловую карту, упорядоченную по кластерам, и экспортируйте список генов, связанных с каждым кластером в таблицу, а затем используйте соответствующий биоинформатический инструмент для определения биологических ролей различных кластеров генов, идентифицированных и сравненных между классами. В этом репрезентативном анализе можно наблюдать эффективный нокдаун и спасение с помощью позитивных и негативных конструкций.

Обратите внимание, что спасенные DAF клетки не смогли сформировать колонии, что свидетельствует о нарушении онкогенной трансформации. После завершения валидации репликантов, фенотипических анализов и первичной обработки данных секвенирования РНК может быть получено количество генов для всех образцов для нормализации и анализа партии. DESeq2 без нормализации партии может привести к искажению дефектов партии, вероятно, из-за биологической изменчивости, вносимой прохождением клеток в культуре, и различий в обработке каждой партии.

После пакетной нормализации DESeq2 может быть использован для создания транскрипционных профилей для интересующих конструктов относительно базового уровня. Анализ главных компонент этих данных позволяет предположить, что транскрипционный профиль DAF является промежуточным между EWS/FLI дикого типа и Delta 22, что подтверждает частичную функцию. Более того, иерархическая кластеризация 1000 наиболее вариабельных генов в образцах показывает, что DAF не может подавить гены-мишени EWS/FLI и лишь частично сохраняет активность активации генов.

Анализ ведущих генов показывает, что классы генов, которые активирует DAF, функционально отличаются от тех мишеней, активированных EWS/FLI, где DAF не функционирует. Интересно, что DAF наиболее способен спасать GGAA-микросателлитные активированные гены, но не способен спасать активированные гены вблизи сайта с высоким сродством. Сопряжение транскриптомного результата с соответствующими фенотипическими анализами завершает анализ структурной функции.

Исследователи также могут использовать другие методы для изучения механистических драйверов различных транскрипционных функций.