Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы
20 октября 2021 г.
Основываясь на пептидной матрице, полученной из вируса гепатита В (HBV), HBV-специфические CD4 Т-клеточные ответы могут быть оценены параллельно с идентификацией HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов.
При хронической инфекции HBV Т-клетки CD4 играют важную роль как в вирусном клиренсе, так и в возврате. Этот метод позволяет нам одновременно оценивать специфические ответы CD4 Т-клеток HBV и идентифицировать эпитопы CD4-клеток HBV. Продемонстрировать процедуру будет Цзяньмэй Сяо, научный сотрудник.
И Син Ван, техник из Билао. Для начала изолируйте мононуклеарные клетки периферической крови, или НБМК, из крови, используя центрифугирование градиента плотности Фиколла в 800 раз больше G в течение 20 минут. Затем соберите гранулоциты между слоем эритроцитов и эритроцитов, используя пастеровую пипетку.
Перенесите размороженный клеточный суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку, добавьте один миллилитр предварительно нагретой бензоназы RPMI 1640, по капле, затем медленно добавьте еще шесть миллилитров. Промыть криокомакон двумя миллилитрами бензоназы RPMI 1640, чтобы извлечь оставшиеся клетки. Затем центрифугируют пробирку в 400 раз G в течение 10 минут.
Удалите супернатант и ослабьте гранулу, постукивая по трубке. Осторожно повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитрах теплой бенсеназы NACE RPMI 1640. Осторожно перемешайте клетки и отфильтруйте их через 70-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, если видны какие-либо клеточные сгустки.
Подсчитывайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Повторно суспендирует НБМК и полную питательную среду, содержащую 10 единиц на миллилитр IL2 и 10 нанограммов на миллилитр IL7. Отрегулируйте плотность ячеек от 1,5x10 до 6 ячеек на миллилитр.
Затем облицовка ячеек в 96-щелетки с плоским дном пластинами с плотностью от 3х10 до пятой ячейки на скважину. Добавьте вирус гепатита В или пулы пептидов, полученных из HBV, в каждую скважину. Для фона и положительного контроля скважин добавьте одинаковое количество растворителя.
Инкубируют пластины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На третий день дополняйте питательную среду 50 единицами на миллилитр IL2 и 10 нанограммами на миллилитр IL7. На седьмой день замените половину питательной среды свежей средой, содержащей: четыре микрограмма на миллилитр пептидов, 100 единиц на миллилитр IL2 и 20 нанограммов на миллилитр IL7.
На 10-й день аккуратно пипетку клеток в каждой скважине семь-девять раз, чтобы дезагрегировать кластеры клеток. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток и перенесите 2x10 в пятую клетку в каждую скважину круглой нижней пластины с 96-ю скважинами для анализа ответа CD4 T-клеток на ВПЧ. Для остаточных клеток в пластине с плоским дном 96-Лунки отрегулируйте объем питательной среды до 100 микролитров, отбросив избыточную среду.
Затем дополняют культуру 100 микролитрами свежей, полной питательной среды, содержащей: четыре микрограмма на миллилитр пептидов, 100 единиц на миллилитр IL2, и 20 нанограмм на миллилитр IL7. Продолжайте культивирование клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа для идентификации эпитопа на 12-й день. Промыть ячейки в круглой нижней пластине с 96 лункой, добавив 200 микролитров RPMI 1640, центрифугируя пластину в 550 раз G в течение трех минут и отбрасывая супернатант.
Повторите промывку дважды, используя полную питательную среду для последней промывки. На каждую лунку клеток, стимулируемых определенным пептидным пулом, добавляют 200 микролитров полной питательной среды, дополненной тем же пептидным пулом. Для background Control Well добавьте полную питательную среду, дополненную одним микролитом на миллилитр DMSO.
Для positive Control Well добавьте полную питательную среду, дополненную одним микролитром на миллилитр DMSO, 150 нанограммами на миллилитр PMA и одной микромолью на литр иономицина. Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе в течение шести часов. После одного часа инкубации добавьте в культуру 1,37 мкг на миллилитр моненсина.
После завершения шестичасовой инкубации центрифугируют пластину в 550 раз G в течение трех минут. Удалите супернатант и промыть клетки один раз 200 микролитрами DP, как было продемонстрировано ранее. Окрашивание для поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8, а также маркер жизнеспособности.
После приостановки ячеек с помощью вибратора, затем охладите пластину при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После однократного промывания пластины 200 микролитрами DPBS зафиксируйте и пронизывайте клетки, окрашивайте внутриклеточными цитокинами, TNF Alpha и Interferon-gamma, а также охлаждаем пластину при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут. Промыть клетки еще раз и повторно приостановить их в 150 микролитрах буфера проточной цитометрии.
Затем получите данные проточной цитометрии с помощью проточная цитометрия. Поддерживайте аллергенных линий B-лимфобластоидных клеток, или BLCL, в колбе T-75. На 12-й день расширения PBMC подсчитайте количество жизнеспособных BLCL и перенесите их на 15-миллилитровые центрифужные трубки.
Центрифугируют клетки в 350 раз G в течение 10 минут и удаляют супернатант. Повторно суспендрить клеточную гранулу и полную культурную среду. Затем аликвотировать LCL на 96-луночную круглую нижнюю пластину при 4x10 до четвертой клетки на лунку и 80 микролитров полной питательной среды.
Добавьте 10 микрограммов на миллилитр одного пептида и установите два фоновых элемента управления. Пульсация пептида при блокировании HLADR и пульсации DMSO. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, в течение двух часов.
Добавьте 100 мкг на миллилитр Митомицина С и инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа. Промыть пластину три раза 200 микролитрами RPMI 1640 для удаления непублированного пептида и митомицина С, затем повторно суспендировать клетки в 120 микролитрах полной питательной среды, используя вибратор. На 12-й день расширения PBMC перенесите НБМК на 96-скважинную круглодонную пластину.
Центрифугируют ячейки в пластине, удаляют супернатант и дважды промывают их 200 микролитрами RPMI 1640, как было продемонстрировано ранее. Повторно приостановите МПК в каждой скважине с 210 микролитрами полной питательной среды. Для PBMC Wells, выбранного для идентификации эпитопов, аликвотирует 70 микролитров клеточной суспензии и смешивается с пептидными импульсными LCL в трех скважинах, включая два фоновых элемента управления.
Инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение шести часов. После одного часа инкубации добавьте в культуру 1,37 мкг на миллилитр моненсина и доведите конечный объем в каждой лунке до 200 микролитров с полной питательной средой. В этом репрезентативном примере ответы альфа-и интерферон-гамма-секретировок CD4 Т-клеток для пула пептидов Core11 ниже, чем в два раза, фоновые значения, следовательно, считаются отрицательными.
Между тем, ответы на пул пептидов Core09 выше, чем в два раза больше фона, и считаются положительными. Серый фон указывает на Уэллса с положительным ответом CD4 Т-клеток, а пептиды-кандидаты для идентификации эпитопов обозначены красным цветом, Core01 имеет самую высокую частоту ответа, судя по клеткам, секретифицивающим CD4T клетки TNF и интерферон-гамма в пулах пептидов колонки. Пептиды C1 до 15, C31 до 45, C61 до 75 и C91 до 105 в этом пептидном пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, поскольку ряд пептидных пулов, содержащих эти пептиды, также показывает положительные результаты.
НБМК, расширенные пулами пептидов Core07, 08, 09 и 10, используются для эпитопной идентификации этих пептидов. Аналогичным образом, Core09 имеет самый высокий уровень отклика в пулах пептидов строк. Все пептиды в этом пуле установлены в качестве пептидов-кандидатов, а PBMCs, расширенные пулами пептидов: Core01, 02, 03, 04, 05 и 06 используются для эпитопной идентификации этих пептидов.
Для пептидного пула Core08 расширенных МПК, после стимуляции пептидом С31 до 45 импульсных БЛКЛ, частоты TNF Альфа и Интерферон-гамма секретирующие CD4 Т-клеток в два раза выше, чем фоновые контрольные. Таким образом, пептид C31-45 является проверенным HLADR ограниченным CD4 Т-клеточным эпитопом. Именно там, дополнительные расширенные НБМК остались после идентификации эпитопа.
Тонкая маркировка идентифицированных эпитопов может быть выполнена с помощью панели укороченные пептиды.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол оценки CD4 T-клеточного ответа специфичного к вирусу гепатита B (HBV) и одновременного определения HBV-специфических эпитопов CD4 T-клеток с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК), полученных от пациентов с хронической HBV-инфекцией. Метод сочетает пептидную стимуляцию, культивирование клеток и проточную цитометрию для характеристики функциональных подмножеств CD4 T-клеток и картирования их антигенных мишеней.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Вирусология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- T-клетки CD4 играют важнейшую роль в иммунном ответе при хроническом гепатите B, влияя как на элиминацию вируса, так и на прогрессирование заболевания.
- T-клетки CD4 могут быть классифицированы на функциональные подмножества в зависимости от секреции цитокинов, такие как Th1 (IFN-γ), Th2 (IL-4, IL-13), Tfh (IL-21) и Th17 (IL-17).
- Понимание специфичности и функции HBV-специфических T-клеток CD4 имеет важное значение для выяснения иммунных механизмов при хроническом HBV-инфицировании.
- Текущие ограничения включают ограниченные знания об эпитопах HBV-специфических T-клеток CD4 и сложности в выделении жизнеспособных антиген-специфических клеток.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать метод оценки ответов CD4 T-клеток, специфичных к HBV, у пациентов с хроническим HBV.
- Идентифицировать эпитопы CD4 T-клеток, специфичных к HBV, с использованием метода пептидной матрицы.
- Охарактеризовать функциональные подмножества CD4 T-клеток, специфичных к HBV, на основе профилей секреции цитокинов.
Используемые методы
- Выделение PBMC из крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности Фиколла.
- Экспансия и стимуляция PBMC пулами пептидов, производных от HBV, в культуре с добавлением IL-2 и IL-7.
- Последовательные этапы культивирования с периодическим добавлением свежей среды и повторной стимуляцией пептидами.
- Анализ ответов CD4 T-клеток методом проточной цитометрии, включая окрашивание поверхностных и внутриклеточных цитокинов (TNF-α, IFN-γ).
- Идентификация эпитопов с использованием B-лимфобластоидных клеточных линий (BLCL), пульсированных пептидами, и кокультивирования с экспандированными PBMC.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет выявлять специфические для HBV ответы CD4 T-клеток путем измерения секреции цитокинов после стимуляции пептидами.
- Положительными ответами считаются секретирующие цитокины CD4 T-клетки, число которых более чем в два раза превышает показатели фонового контроля.
- Метод позволяет картировать кандидатные и верифицированные эпитопы CD4 T-клеток в пулах пептидов HBV.
- Точное картирование эпитопов может быть выполнено с использованием панелей укороченных пептидов.
Выводы
- Данный подход обеспечивает надежную платформу для одновременной оценки ответов CD4 T-клеток, специфичных к HBV, и идентификации эпитопов.
- Метод облегчает функциональную характеристику субпопуляций CD4 T-клеток при хронической HBV-инфекции.
- Он может быть адаптирован для дальнейших детальных исследований антигенспецифических T-клеточных ответов при вирусных инфекциях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежная идентификация и функциональное профилирование специфических для HBV эпитопов CD4 T-клеток имеют решающее значение для снижения рисков при выборе иммунологических мишеней и развития портфелей разработок противовирусных препаратов. Данный рабочий процесс на основе пептидных матриц позволяет одновременно проводить количественную оценку антигенспецифических ответов и картирование эпитопов, что обеспечивает прогностическую достоверность на ранних этапах иммунологических программ. Такой подход усиливает трансляционную преемственность, предоставляя практически значимые данные для валидации мишеней и механистического снижения рисков в исследованиях хронического гепатита B.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой анализ ответов HBV-специфических CD4 Т-клеток для функциональной валидации мишеней.
- Способствует механистическому снижению рисков путем картирования HLA-DR-ограниченных эпитопов, значимых для иммуномодуляции.
- Облегчает сортировку портфеля препаратов за счет дифференциации иммунодоминантных и субдоминантных Т-клеточных мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные системы на основе PBMC для последующих рабочих процессов иммунологического скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели цитокинов для стандартизации и сравнительного анализа анализа.
- Позволяет проводить масштабируемый скрининг библиотек пептидов для поиска эпитопов и иммунного профилирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные о функциональном состоянии T-клеток с иммунными сигнатурами, имеющими значение при хронической инфекции HBV.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет возможности точного картирования эпитопов.
- Создает основу для разработки трансляционных биомаркеров в рамках разработки противовирусных препаратов и методов иммунотерапии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрирован в процесс иммунологических исследований, охватывающий этапы от ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров до трансляционных исследований хронических вирусных заболеваний.
- Открытия в биологии: Оказывает поддержку в проверке гипотез и уточнении сигнальных путей посредством количественной оценки антигенспецифических ответов Т-хелперов CD4.
- Скрининг: Обеспечивает создание воспроизводимых систем ПБКМ, готовых к анализу, с количественным определением выработки цитокинов для иммунологического скрининга.
- Аналитика: Предоставляет данные измерений методом проточной цитометрии и статистические пороги для определения положительного ответа.
- Трансляционные исследования: Позволяет картировать значимые для заболевания эпитопы для согласования биомаркеров и терапевтических мишеней.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает универсальную платформу для поиска эпитопов для различных вирусных и иммунологических мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает неоднозначность механизмов при валидации иммунных мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует анализы на основе PBMC для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости в иммунологических рабочих процессах.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет фокусирования на валидированных иммунных мишенях.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение иммуномодулирующих кандидатов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения PBMC, пептидной стимуляции и анализа методом проточной цитометрии.
- Необходим доступ к высококачественному аналитическому оборудованию и инфраструктуре для культивирования клеток.
- Требуется межкомандная стандартизация измерения цитокинов и порогов отклика.
- Может потребоваться адаптация для различных HLA-типов или вирусных антигенов.
- Результат зависит от наличия хорошо охарактеризованных библиотек пептидов и валидированных контролей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Isolation of PBMCs and In Vitro Expansion Using an HBV Peptide Matrix
3:55
Analysis of HBV-specific CD4 T-Cell Responses by Intracellular Flow Cytometry
5:54
Identification of HBV-specific HLA-DR Restricted CD4 T-Cell Epitopes
8:07
Results: Identification of HBV-specific HLA-DR Restricted CD4 T-Cell Epitopes
10:06
Conclusion
