Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

Протокол, описанный здесь, описывает быстрый и эффективный метод измерения нейтрализующих антител против спайкового белка SARS-CoV-2 путем оценки способности реконвалесцентных образцов сыворотки ингибировать инфекцию усиленным зеленым флуоресцентным белком меченым вирусом везикулярного стоматита, псевдотипизированным с шиповым гликопротеином.

Этот метод дает способ ответить на один из наиболее важных вопросов, касающихся разрабатываемых вакцин против SARS-коронавируса-2. Способна ли вакцина вызывать нейтрализующий ответ антител? Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть выполнена в защитной изоляции второго уровня.

Он также относительно быстрый и недорогой, что делает его хорошо подходящим для анализа многих образцов одновременно. Демонстрируя процедуру нейтрализации кислоты, у нас есть Рикардо Мариус, старший техник в лаборатории и Тейлор Джеймисон, аспирант MD. Начните с культивирования клеток Vero E6 в DMEM, дополненных 10% FBS при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Чтобы пройти клетки, сначала вымойте их, добавив 10 миллилитров PBS и осторожно раскачивая блюдо четыре-пять раз. После аспирации PBS добавьте три миллилитра трипсина ЭДТА и покачайте блюдо, чтобы убедиться, что вся поверхность покрыта перед инкубацией при 37 градусах Цельсия. Как только клетки отделяются, деактивируйте трипсин, добавив семь миллилитров DMEM, дополненных 10% FBS, а затем повторно суспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз несколько раз.

Удалите трипсин центрифугированием и аспирировать супернатант, не нарушая клеточную гранулу, прежде чем повторно сусминать клетки в 10 миллилитрах свежего DMEM. После подсчета добавляйте примерно один раз 10 к седьмой клетке к каждой 15-сантиметровой пластине и инкубируют культуру в течение одного-двух дней, пока клетки не будут на 100% сливаться. Чтобы подготовить vsv спайковый псевдовирус EGFP к титрованию, инфицировать клетки при кратности заражения 0,01 стоковым вирусом, разведенным в 12 миллилитрах бессывороточного DMEM.

После добавления вируса инкубируют клетки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с периодическим раскачиванием. В конце инкубации замените инокуляту свежим DMEM, дополненным 2% FBS и 20 миллимолярными кучами, затем инкубируют клетки при 34 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. На следующий день используйте флуоресцентный микроскоп для визуализации экспрессии EGFP инфицированных клеток.

Как только наблюдается обширный цитопатический эффект и отслоение клеток, соберите супернатант культуры и удалите мусор центрифугированием. Чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания, аликвотирует супернатант перед хранением при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы определить вирусный титр, пластинчатые клетки Vero E6 в шести колодцах пластин при плотности посева от шести раз 10 до пятой клетки на скважину и инкубируют в течение ночи.

На следующий день установили десятикратную серию серийного разведения вирусного запаса, добавив 900 микролитров среды к семи микроцентрифужным трубкам и добавив 100 микролитров вирусного запаса в первую трубку. После кратковременного вихря перенесите 100 микролитров разбавленного вируса в каждую последующую трубку, вихрев между каждой трубкой. Затем замените супернатант в каждой лунки культурального листа Vero E6 на 500 микролитров от 10 до минус секунды до 10 до минус седьмого вирусного разведения.

После 45-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры с аккуратным раскачиванием каждые 15 минут замените инокуляту накладным раствором и инкубируйте клетки при 34 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов. В конце инкубации, чтобы визуализировать бляшки путем окрашивания кристаллического фиолетового цвета, промыть клетки один раз PBS, прежде чем добавлять два миллилитра 0,1% кристаллического фиолетового цвета в каждую лунку. Поместите пластину на коромысло в течение примерно 20 минут при комнатной температуре, прежде чем аккуратно промыть каждую скважину два раза PBS.

После последней промывки дайте пластинам высохнуть на воздухе в течение не менее одного часа, прежде чем использовать формулу, указанную для расчета титра вируса в каждой скважине в единицах образования бляшек на миллилитр. Для пластинчатых ячеек для анализа нейтрализации используют многоканальный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров ячеек Vero E6 в каждую лунку пластины из 96 лунок при плотности в два раза 10 к пятой ячейке на миллилитр и инкубировать пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день тепло инактивирует образцы сыворотки пациента, которые должны быть проверены на водяной бане с температурой 56 градусов цельсия в течение 30 минут.

Затем устанавливают десятикратную серию разведения образцов сыворотки пациента в пустой 96-луночной пластине для культивирования тканей, добавляя восемь микролитров сыворотки к 72 микролитрам безсыворочного DMEM с антибиотиками в каждой лунке ряда A.Затем добавьте 40 микролитров безсыворочного DMEM к каждой лунке рядов B до G и 80 микролитров к каждой лунке ряда H.Используя 12-луночную многоканальную пипетку, смешать образцы в строке A, затем перенести 40 микролитров образца из каждой скважины ряда A в каждую лунку ряда B. После смешивания повторите разбавление для каждого последующего ряда скважин до ряда F.Далее добавьте 40 микролитров VSV spike EGFP при кратности заражения 0,05 к каждой скважине в рядах A до G, и перемешать, пипетируя четыре-пять раз перед инкубацией пластины в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. В конце инкубации осторожно аспирируют супернатант из каждой лунки культуральной пластины Vero E6 и переносят 60 микролитров смеси вируса антител из каждой лунки пластины разбавления образца в соответствующий колодец пластины клеточной культуры. Когда все образцы будут переданы, поместите пластину клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа с раскачиваемостью каждые 20 минут.

После завершения инкубации добавляют 140 микролитров накладного раствора карбоксиметилцеллюлозы в каждую лунку пластины клеточной культуры и переносят пластину в инкубатор с содержанием диоксида углерода 34 градуса Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа визульцируйте пластины на автоматизированном флуоресцентном томообразователье с длиной волны 488 нанометров и используйте функцию автоматического подсчета томорабля для количественной оценки отдельных очагов EGFP. В этом репрезентативном примере коммерчески доступное нейтрализующее антитело против домена связывания спайк-рецепторов SARS-coronavirus-2 использовалось в качестве положительного контроля, наряду с IgG в качестве отрицательного контроля.

Процент ингибирования был рассчитан на основе количества очагов EGFP, обнаруженных с помощью флуоресцентной визуализации. Нейтрализация псевдовируса образцами выздоравливающих пациентов, собранными примерно через три месяца после заражения SARS-коронавирусом-2, показала, что госпитализированные пациенты продемонстрировали повышенную нейтрализующую способность по сравнению с теми, кто не требовал госпитализации. Эта процедура также может быть использована для оценки других профилактических и терапевтических агентов COVID-19, которые направлены на блокирование вирусной инфекции.