Получение, поддержание и характеристика органоидов кишечника и толстой кишки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

Следующий протокол описывает создание органоидов кишечника и толстой кишки человека из плюрипотентных стволовых клеток человека. Эта техника позволит пользователю исследовать пути, участвующие в формировании кишечника. Этот метод позволяет пользователю создавать изогенные органоиды, специфичные для региона. Этот протокол может дать представление о факторах, которые регулируют создание и поддержание структуры кишечника.

[Рассказчик] Начните с помещения внеклеточного матрикса или 24-луночного планшета с покрытием ECM в шкаф биобезопасности на 30 минут, чтобы он достиг комнатной температуры. Поместите полный раствор для отслоения средних клеток mTeSR1 и усовершенствованный DMEM в ванну с шариками при температуре 37 градусов Цельсия и дайте им прогреться в течение 30 минут. Приготовьте среду для покрытия в конической пробирке объемом 50 миллилитров, добавив 13 миллилитров mTeSR1 и 13 микролитров 10 миллимолярных Y-27632 Rho-ассоциированной протеинкиназы или ингибитора ROCK. Чтобы собрать клетки из шестилуночного планшета, отсадите среду из трех до четырех лунок и промойте один раз двумя миллилитрами усовершенствованного DMEM на лунку. Отсадите усовершенствованный DMEM и внесите по одному миллилитру раствора для диссоциации клеток в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение пяти-семи минут в инкубаторе с 5% углекислым газом и температурой 37 градусов Цельсия. Диссоциируйте любые скопления клеток, пипетируя вверх и вниз четыре-пять раз с помощью пятимиллилитровой пипетки для приготовления клеточной суспензии. Добавьте в каждую лунку по два миллилитра усовершенствованного DMEM. Аккуратно пипеткой вверх и вниз четыре-пять раз и переложите в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Уменьшите количество клеток при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре. Отсасывайте среду из пробирки, не отсасывая клеточную гранулу. И добавьте шесть миллилитров подготовленной среды mTeSR1 плюс ингибитор ROCK. Аккуратно ресуспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз три-четыре раза. Затем перенесите суспензию в остальную среду ингибитора mTeSR1 и ROCK внутрь 50-миллилитровой пробирки. Энергично суспензируйте четыре-пять раз и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отсасывайте ВКМ из 24-луночного планшета непосредственно перед нанесением покрытия на клетки. Снова суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз два-три раза, и дозируйте 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку. Аккуратно покачивайте пластину три раза по часовой стрелке, три раза против часовой стрелки, три раза вперед и назад и три раза из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить ячейки. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом и инкубируйте в течение 24 часов. Через 24 часа отсасывайте отработанную среду. Добавьте 0,5 миллилитра на лунку mTeSR1 и снова инкубируйте в течение 24 часов в тех же условиях. Приготовьте готовую среду первого дня Activin, разбавив 100 микрограммов на миллилитр стокового раствора Activin A и 100 микрограммов на миллилитр BMP4 в среде первого дня Activin в конической пробирке. Прогрейте среду в ванне с шариками при температуре 37 градусов Цельсия. Отсадите среду mTeSR1 из 24-луночного планшета и добавьте 0,5 миллилитра Активина в день по одной среде в лунку. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом и инкубируйте в течение 24 часов. Проверьте ячейки через 24 часа. Приготовьте готовую среду Activin второго дня, разбавив 100 микрограммов на миллилитр исходного раствора Activin A в среде Activin второго дня в конической пробирке, и поместите пробирку в ванну с шариками при температуре 37 градусов Цельсия. Снимите 24-луночную дифференцировочную пластину с инкубатором углекислого газа и удалите отработанную среду. Выдайте 0,5 миллилитра предварительно подогретого Активина в день две среды на лунку и поместите пластину обратно в инкубатор с углекислым газом на 24 часа. Приготовьте готовую среду для третьего дня Activin, разбавив 100 микрограммов на миллилитр стокового раствора Activin A в среде Activin на третий день в конической пробирке, и поместите пробирку в ванну с шариками при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите отработанную среду и выдайте 0,5 миллилитра Активина в день три среды на лунку. Чтобы начать с дифференциации дефинитивной энтодермы на сфероиды средней задней кишки, добавьте 25 миллилитров индукционной среды средней задней кишки с FGF4 в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и поместите ее в ванну с шариками при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут. Чтобы приготовить полную среду для индукции средней задней кишки, добавьте 7,5 микролитров CHIR99021 после того, как среда нагреется. Удалите отработанную среду, выдайте 0,5 миллилитра индукционной среды средней задней кишки на лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 24 часов. После того, как на следующий день произошла конденсация клеток внутри монослоя, замените отработанную среду свежей средой для индукции средней задней кишки и поместите планшет обратно для инкубации на 24 часа. Чтобы избежать выброса плавающих сфероидов при смене среды, перелейте старую среду в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 300 G в течение одной минуты. Ресуспендируйте сфероиды в 12,5 миллилитров свежей среды для индукции средней задней кишки, добавьте 0,5 миллилитра на лунку в ту же 24-луночную пластину и инкубируйте в течение 24 часов в инкубаторе. На четвертый день индукции задней кишки соберите плавающие сфероиды из пластинчатых лунок, собрав среду в пробирку объемом 15 миллилитров, после чего следует центрифугирование при 300 G в течение одной минуты. Эффективность окончательной индукции энтодермы оценивали путем проведения иммунофлуоресцентного окрашивания FOXA2 и SOX17. Было обнаружено, что экспрессия мРНК переднего HOX-фактора HOXD3 была самой высокой в кишечных органоидах или HIO человека, обработанных Noggin, меньшей в эпителиальном факторе роста или HIO, обработанных EGF, и самой низкой в органоидах толстой кишки человека, обработанных BMP. И наоборот, экспрессия мРНК HOXA13 и HOXD13 была низкой в HIO и высокой в HCO. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили для SATB2, CDX2 и CDH1, чтобы определить, правильно ли структурирован эпителий HCO.