Анализ сырых и обработанных образцов корневища ципери методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии у крыс с первичной дисменореей

Метабономика измеряет общие и динамические метаболические реакции и согласуется с определением общей эффективности традиционной китайской медицины. Изменения компонентов препарата, обусловленные метаболической реакцией организма, могут быть определены с помощью метабономики. Объем скрининга активных ингредиентов ТКМ может быть сужен с помощью этого метода.

Односторонности можно избежать, изучив отдельные составляющие. Этот метод может быть одновременным, определять эндогенные метаболиты и экзогенные составляющие, всасываемые в кровь. Метабономика широко используется в исследованиях ТКМ, лекарственной токсикологии, управления здравоохранением, спорта, продуктов питания и других областях.

Для начала определите необходимый экстракт корневища Cyperi, или CR, или корневища Cyperi, обработанного уксусом, или CRV, для лечения группы из шести крыс Sprague Dawley в течение трех дней. Рассчитайте объем CR или CRV, который будет применяться на одну крысу, используя это уравнение. Для обработки CRV тщательно смешайте 100 грамм CR и 20 грамм уксуса, в котором на 100 миллилитров приходится более 5,5 граммов уксусной кислоты, и выдерживайте в течение 12 часов.

После инкубации обжарьте смесь на железной сковороде в течение 10 минут при температуре от 110 до 120 градусов Цельсия. Затем удалите смесь и дайте ей остыть при комнатной температуре. Чтобы приготовить экстракт CR, замочите CR на два часа чистой водой, в 10 раз превышающей количество CR, убедившись, что лекарственные материалы находятся ниже уровня жидкости.

Затем доведите смесь воды и лекарства до кипения на сильном огне и держите ее кипеть на слабом огне в течение 20 минут. Затем отфильтруйте содержимое через фильтровальную ткань 100 меш и соберите фильтрат. Затем сконцентрируйте собранный фильтрат в экстракт с помощью роторного испарителя до одного грамма на миллилитр.

Чтобы приготовить экстракт CRV, выполните этапы замачивания, кипячения и концентрирования, как показано для экстракции CR. Для тестирования экстрактов CR и CRV пипеткой 500 микролитров экстракта до 500 микролитров метанола в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках и перемешивайте в течение 30 секунд. Центрифугируют образцы в течение 15 минут при 16 500 г при четырех градусах Цельсия.

Затем удалите надосадочную жидкость и перенесите ее во флакон с образцом для тестирования. После тестирования образцов выполните анализ главных компонент (PCA) и моделирование с помощью программного обеспечения для анализа. Импортируйте стандартизированные данные метаболитов в программное обеспечение, а затем используйте автоподбор для построения модели анализа.

Наконец, используйте баллы, чтобы получить точечную диаграмму оценки PCA. Чтобы выполнить ортогональный частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов, или OPLS-DA, импортируйте стандартизированные данные о метаболитах и группах CR и CRV в программное обеспечение. Затем импортируйте данные CR и CRV в соответствующие созданные группы.

Затем используйте автоподбор для построения расчетной модели и используйте оценку для получения точечной диаграммы оценок OPLS-DA. Наконец, используйте VIP для получения переменной значимости в проекции или значения VIP в OPLS-DA. Чтобы идентифицировать потенциально дифференциальные метаболиты, отсеивайте метаболиты со значениями VIP больше единицы.

Затем используйте статистическое программное обеспечение для расчета P-значения скрининговых метаболитов с помощью Т-критерия студента. Затем, чтобы идентифицировать дифференциальные метаболиты, используйте аннотированные метаболиты и отсеивайте дифференциальные метаболиты, которые должны быть сопоставлены в базе данных KEGG. Покажите изменения дифференциальных метаболитов в группах CR и CRV, нарисовав тепловую карту.

Чтобы изучить потенциальные метаболические пути, перейдите к базе данных MetaboAnalyst. Используйте анализ путей для загрузки различных метаболитов для получения потенциальных метаболических путей. Загрузите различные метаболиты в базу данных KEGG для анализа потенциальных метаболических путей.

Проанализированный модельный эксперимент по дисменорее показал значимые различия в уровнях простагландинов. Крысы в модельных группах CR и CRV показали значительные извивающиеся реакции после инъекции окситоцина. Результаты анализа PCA показали, что кластеры CR и CRV по сравнению с модельными группами были достоверно разделены как по положительным, так и по отрицательным ионным модам.

OPLS-DA использовался для скрининга метаболических различий, а результаты диаграммы рассеяния показали, что группы CR и CRV были разделены. Для выявления метаболических изменений был проведен одномерный статистический анализ. Показан график вулкана, на котором каждая точка соответствует отдельному метаболиту.

Значительные изменения наблюдались у 63 метаболитов в положительном режиме и 30 в отрицательном режиме. Дифференциальные метаболиты были определены с использованием баз данных KEGG и HDMB, и были перечислены точно совпадающие соединения. Были рассчитаны и кластеризированы количественные значения дифференциальных метаболитов между группами CR и CRV.

Цветовые пятна показывают, как каждый метаболит экспрессируется по отношению к другим. По сравнению с группой CR уровни четырех дифференциальных метаболитов в группе CRV увеличились, в то время как 11 метаболитов снизились в режиме положительных ионов. В случае отрицательной ионной моды четыре дифференциальных метаболита увеличивались, а семь метаболитов уменьшались.

Результаты анализа путей KEGG показали, что дифференциальные метаболиты были связаны с девятью путями в положительном и отрицательном режимах. Чем больше дифференциальных метаболитов, тем лучше результаты, поэтому может быть связано достаточное количество метаболических путей, и ключевые метаболические пути, проверенные скринингом, будут более точными.