Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

Этот протокол предоставляет практические знания, полезные для создания наноразмерных частиц, т.е. нанодисков, которые стабильно включают широкий спектр гидрофобных биологически активных молекул. Этот метод имеет множество практических применений.

Способность придавать растворимость в воде нерастворимым биологически активным соединениям позволяет использовать нанодиски в приложениях для доставки лекарств. Описанный метод прост. Предпочтительно проводить исследования в описанном масштабе, пять миллиграммов фосфолипида, два миллиграмма каркасного белка, так что образование нанодисков легко контролируется визуальным осмотром.

Продемонстрируют процедуру Майкл Каро и Мэтью Свакхаммер, студенты-исследователи в лаборатории Райана. Чтобы приготовить аликвоту фосфолипида, взвесьте пять миллиграммов DMPC и перенесите его в стеклянную пробирку. Растворите фосфолипид, добавив 300 микролитров хлороформа и 100 микролитров метанола в соотношении три к одному.

Выпарить органический растворитель, поместив стеклянную пробирку под мягкую струю газообразного азота на 10-15 минут, так что вдоль стенок нижней части пробирки образуется тонкая пленка высушенного фосфолипида. Чтобы получить амфотерицин B или AmpB-нанодиски, нанесите пипеткой 450 микролитров PBS на лиофилизированный фосфолипид аликвоту и встряхните в течение 30 секунд, чтобы диспергировать липид. Пипеткой 50 микролитров по 20 миллиграммов на миллилитр наберите раствор AmpB в дисперсный образец фосфолипида и вихрит.

Добавьте 500 микролитров четырех миллиграммов на миллилитр каркасного белка ApoE4 NT в стеклянную пробирку, содержащую дисперсный фосфолипид и AmpB. Ванну обрабатывают ультразвуком при температуре 24 градуса Цельсия до тех пор, пока раствор не осветится. Для диализа AmpB-Nanodisk подготовьте секцию диализной трубки, тщательно замочив ее в дистиллированной деионизированной воде на 10 минут.

Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, чтобы жидкость не могла выйти. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и перенесите образец AmpB-Nanodisk в диализную трубку. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.

Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий свежеприготовленный буфер PBS объемом в один литр. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и установите регулятор перемешивания на низкий уровень, чтобы избежать вихря. Позвольте диализу продолжаться в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, и подключитесь к соответствующему вспомогательному компьютеру, нажав кнопку управления ПК. На компьютере поддержки откройте программное обеспечение с надписью UVProbe 2.61 и подключитесь к спектрофотометру, нажав «подключиться» в левом нижнем углу. Нажмите на спектр, затем нажмите метод"на верхней панели инструментов.

Нажмите на вкладку измерения и введите 500 в начальное текстовое поле, расположенное в разделе «Диапазон длин волн», и 300 в конец«текстовое поле». Щелкните раскрывающееся меню рядом с вкладкой с надписью «Скорость сканирования»и установите его на средний. Подготовьте заготовку образца, перелив один миллилитр ДМСО в две кварцевые кюветы.

Загрузите обе кюветы в соответствующие отверстия спектрофотометра. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров, нажав «Пуск»в левом нижнем углу. Для стандартного спектрального анализа AmpB извлеките кювету из переднего отверстия для образца и добавьте 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр исходного раствора AmpB.

Загрузите кювету обратно в доску для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. После регистрации поглощения образца извлеките кювету и сцедите жидкое содержимое в контейнер для отходов. Тщательно промойте кювету тремя промывками деионизированной воды, а затем тремя промывками с 70% этанолом.

Для спектрального анализа разрушенного AmpB-нанодиска подготовьте образец путем пипетирования 20 микролитров одного миллиграмма на миллилитр AmpB-нанодиска в один миллилитр ДМСО и инкубируйте в течение одной минуты перед записью спектра. Загрузите кювету в передний порт для образцов и нажмите «Пуск», чтобы записать поглощение образца. Для спектрального анализа заготовки буфера PBS подготовьте заготовку, перелив один миллилитр PBS в две кварцевые кюветы.

Загрузите кюветы в порт для образцов. Нажмите «Авто пусто» и запишите спектр от 300 до 500 нанометров. Для спектрального анализа образца AmpB-Nanodisk без разрушений извлеките кювету из переднего порта образца и добавьте 20 микролитров образца AmpB-Nanodisk объемом один миллиграмм на миллилитр в буфер PBS.

Загрузите кювету обратно в доску для образцов. Нажмите «Пуск» и запишите спектр выборки. Реакция приготовления AmpB-Nanodisk считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному.

Показана спектроскопия УФ-видимого поглощения образцов AmpB в ДМСО и ПБС. В ДМСО наблюдались три отличительных максимума поглощения на 372, 392 и 415 нанометров, пики, указывающие на AmpB. Спектры поглощения AmpB-нанодисков в PBS показали один крупный пик поглощения на более короткой длине волны.

Для сравнения, спектры поглощения AmpB-нанодисков в ДМСО оказались похожи на спектры стоковых AmpB. Биологическую активность AmpB-нанодисков проводили путем оценки анализа ингибирования роста дрожжей. Контрольные образцы, такие как PBS, DMSO и восстановленные липопротеины высокой плотности, продемонстрировали, что компоненты нанодисков, отличные от AmpB, не оказывают заметного влияния на рост дрожжей.

Положительный контроль подтвердил, что AmpB является эффективным ингибитором роста дрожжей. В случае AmpB-нанодисков наблюдалась концентрация-зависимая активность ингибирования роста. Не все препараты нанодисков одинаковы.

Некоторым может потребоваться больше времени, другие липиды или разные белки каркаса. Они лишь нечеткие} - это осветление образца нанодиска. Этот метод привел к созданию новых наночастиц, используемых для изучения кардиотоксичности, апоптоза, лигандных взаимодействий, вызванных доксорубицином, и доставил многочисленные водные нерастворимые биологически активные молекулы, включая лютеин и куркумин.