Моделирование лигандов в карты, полученные с помощью электронной криомикроскопии
19 июля 2024 г.
Этот протокол знакомит с инструментами, доступными для моделирования низкомолекулярных лигандов в криоЭМ-картах макромолекул.
Мы заинтересованы в понимании физиологических процессов, происходящих в клетке, в частности на границе мембраны. Мы используем Cryo-EM в качестве основного метода и работаем над различными интересными и сложными биологическими проблемами, изучающими множественные высокомолекулярные комплексы. Определение структуры мембранных белков и других лабильных комплексов было сложной задачей еще пару десятилетий назад.
Тем не менее, технические достижения в области Cryo-EM, нового моющего средства и липидного миметика, а также с надлежащими способностями проложили путь к быстрому определению структуры этих комплексов. Эти структуры теперь могут быть получены с высоким разрешением и потенциально использованы при разработке лекарств. При использовании крио-ЭМ с одной частицей сложность включает в себя получение стабильного и однородного образца, встраивание образца в случайную ориентацию в тонкий лед, обработку большого количества изображений с низким отношением сигнал/шум, а также точное определение угловой ориентации и классификации во время 3D-реконструкции.
Идентификация и моделирование малых молекул в крио-ЭМ картах белковых комплексов лиганда является сложной задачей из-за присущего данным шума, а также изотропного и низкого разрешения карты, гетерогенности образца и гибкости лиганда. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по идентификации и моделированию лигандов и молекул растворителей в крио-ЭМ с низким и средним разрешением.
Обзор
В данном протоколе представлены инструменты, доступные для моделирования низкомолекулярных лигандов на картах криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) макромолекул. Исследование сосредоточено на изучении физиологических процессов на мембранном интерфейсе с помощью криоЭМ для решения различных биологических задач.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная микроскопия (cryoEM)
- Макромолекулярные комплексы
- Разработка лекарственных препаратов
Теоретические основы
- Понимание физиологических процессов в клетке.
- Трудности определения структур мембранных белков.
- Достижения в методах криоэлектронной микроскопии (cryoEM).
- Значение структур высокого разрешения для разработки лекарственных препаратов.
Цель исследования
- Для моделирования низкомолекулярных лигандов на картах криоэлектронной микроскопии (cryoEM).
- Для углубления понимания структур мембранных белков.
- Для ускорения определения структуры лабильных комплексов.
Используемые методы
- Метод криоэлектронной микроскопии отдельных частиц.
- Замораживание образцов в тонком слое льда.
- Обработка изображений с низким отношением сигнал/шум.
- 3D-реконструкция и классификация угловой ориентации.
Основные результаты
- Получены структуры мембранных белков высокого разрешения.
- Успешное моделирование низкомолекулярных лигандов на картах cryoEM.
- Преодоление проблем со стабильностью и гомогенностью образцов.
- Расширение возможностей поиска новых лекарственных средств за счет структурных данных.
Выводы
- Криоэлектронная микроскопия (CryoEM) является мощным инструментом для изучения макромолекулярных комплексов.
- Моделирование лигандов позволяет глубже понять механизмы взаимодействия лекарственных веществ.
- Технический прогресс продолжает способствовать развитию исследований в области структурной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Высокоразрешающее моделирование взаимодействий белков с лигандами с использованием карт криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) приобретает всё большее значение для ранних этапов разработки лекарственных препаратов и снижения рисков при изучении механизмов действия. Способность точно определять и уточнять связывание лигандов в сложных макромолекулярных ансамблях повышает прогностическую уверенность при валидации мишени и помогает в принятии решений по приоритизации портфеля препаратов. Интеграция передовых рабочих процессов криоЭМ позволяет биофармацевтическим группам устранять структурную неопределенность и ускорять идентификацию ведущих соединений на основе структуры.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую визуализировать сайты связывания лигандов и сети взаимодействий в макромолекулярных комплексах.
- Способствует снижению механистических рисков путем выяснения структурной основы взаимодействия с мишенью.
- Повышает прогностическую уверенность при функциональной валидации мишеней и последующем отборе кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных структурных моделей для рабочих процессов вычислительного и экспериментального скрининга.
- Обеспечивает воспроизводимую идентификацию плотности лигандов и количественную оценку режимов связывания.
- Поддерживает стандартизацию анализа, предоставляя эталонные структуры для состояний с связанным лигандом и апо-состояний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет структурные данные с системами, имеющими значение для заболевания, путем моделирования физиологически важных комплексов.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет поддержки оптимизации на основе структуры.
- Снижает трансляционный риск, подтверждая взаимодействие лиганда в соответствующих биологических ансамблях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс моделирования лигандов на основе криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) связывает этапы раннего поиска, идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, предоставляя высокоточные структурные данные для проверки гипотез и оптимизации соединений.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о связывании лигандов и модуляции сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных карт плотности лигандов для сравнительного анализа.
- Аналитика: предоставляет уточненные атомные координаты и разностные карты для статистической оценки событий связывания.
- Трансляционные исследования: связывают структурные данные с мишенями, имеющими значение для заболеваний, и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное использование: создает масштабируемый стандартизированный рабочий процесс для текущих инициатив по разработке лекарств на основе структуры.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует моделирование и оптимизацию лигандов для различных белковых систем.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения структурных рисков на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение структурно валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуются навыки обработки данных криоэлектронной микроскопии (криоЭМ), построения моделей и использования программного обеспечения для их уточнения.
- Необходим доступ к высокопроизводительной вычислительной инфраструктуре и средствам визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация порогов карт, критериев валидации и уточнения координат.
- Может потребоваться адаптация для различных классов белков, типов лигандов или режимов разрешения.
- Результат зависит от качества образца, разрешения карты и ограничений, связанных с уровнем шума в данных криоЭМ.
