Микрожидкостных Заявки на одноразовые диагностики

Меня зовут Кэтрин КлаудБридж, и я профессор производства, инженерии и биомедицинской инженерии в Бостонском университете. Я являюсь директором Биомедицинской лаборатории микроустройств и микроокружений. Мы работаем в первую очередь над созданием одноразовой диагностики для приложений в условиях ограниченных ресурсов.

Поэтому мы используем микрофлюидики для создания этих устройств. На самом деле нас интересуют две области знаний. В первую очередь нас интересует изучение того, как биомолекулы и клетки взаимодействуют с пластиковыми полимерными поверхностями.

Это наш главный зонтик. Эта работа воплощается в микрофлюидных приложениях для одноразовой диагностики. Поэтому в лаборатории мы производим микрофлюидные устройства.

В термопластичных материалах мы не используем, обычно используем PDMS, это резиновый материал, который большинство людей используют для создания микрофлюидики в лаборатории. Мы изготавливаем наши устройства из термопластов. Мы заинтересованы в использовании этих термопластичных устройств для проведения молекулярной биологии на микроуровне таким образом, чтобы эту молекулярную биологию можно было проводить в полевых условиях, удаленных от централизованной лаборатории.

Как это работает в лаборатории: мы делаем маленькие пластиковые карточки, и внутри этих маленьких пластиковых карточек находятся колонки для экстракции твердой фазы, или колонки для лизиса клеток, или колонки для смешивания. Мы также проводим полимеразную цепную реакцию на чипе в качестве метода обнаружения. Все эти вещи интегрированы в небольшое устройство, которое в конечном итоге, в долгосрочной перспективе исследования, превратится в интегрированное устройство, которое можно будет держать в руках и проводить в полевых условиях или в условиях, где не будет доступной крупномасштабной лаборатории со всеми сопутствующими центрами, сплавами и нагревательными инкубаторами и так далее.

Так что в идеале мы хотели бы начать с человеческого образца, такого как кровь, моча, стул или мазок из носоглотки, например, который будет слизью. И тогда на выходе чипа есть ответ, да или нет, заражен ли кто-то тем или иным микроорганизмом. И мы делаем это путем поиска ДНК этого конкретного или РНК, в зависимости от микроорганизма этого конкретного микроорганизма в образце пациента.

Таким образом, технические проблемы, которые возникают, в основном связаны с подготовкой образцов в этом уравнении. Поэтому, когда вы начинаете с крови, стула или мочи, вам приходится переходить от ситуации, когда у вас есть грязный человеческий образец с большим количеством потенциально твердых частиц или ингибиторов, к ПЦР или другим методам амплификации. И вы хотите закончить с очень чистым ускользающим образцом нуклеиновых кислот, который вы затем можете использовать для амплификации или поиска определенной ДНК или РНК, которая скажет вам, был ли там микроорганизм, который вы ищете.

Итак, чтобы очистить эти образцы, вам нужно сделать несколько вещей. Во-первых, необходимо отфильтровать образец, что, в зависимости от образца, может включать в себя фильтрацию курса или быстрый этап отжима перед тем, как образец попадет на чип. Поэтому мы всегда стараемся начинать с образцов по мере их поступления от врача.

Итак, при анализе мочи, кала и мазков из носоглотки наша цель состоит в том, чтобы врач просто выполнял свою работу, как обычно, и брал образец, как обычно. Затем мы берем этот образец и помещаем его на чипы. Таким образом, если на этом этапе потребуется дополнительная фильтрация, эта фильтрация произойдет в чипе.

Второй шаг включает в себя, поскольку мы проводим молекулярные анализы, мы должны лизировать клетки и микроорганизмы, которые находятся в этом образце. Затем мы выполняем этап лизиса, который обычно включает в себя проталкивание образца через фильтр с небольшим размером пор. Иногда этот фильтр также содержит наночастицы, такие как углеродные нанотрубки с острыми краями, которые могут быть использованы для разрушения некоторых организмов с более прочными клеточными стенками, таких как C. difficile, грамположительная бактерия, с которой мы работаем, которую очень трудно лизовать.

Поэтому нам нужны более надежные лизисные колонны. Но обычно мы проводим комбинированный химический и механический лизис внутри чипа. После этого наша цель состоит в том, чтобы взять лизат, а затем извлечь очищенные нуклеиновые кислоты.

Итак, мы пропускаем лизис, мы пропускаем лизат через колонну твердофазной экстракции, которая резонирует в микрофлюидном чипе. Эта твердофазная экстракционная колонка сделана из пластика и изготовлена с использованием фото-инициируемой химии внутри микрофлюидного канала после того, как она уже изготовлена. И он также пропитан частицами кремнезема, потому что мы хотим связывать и высвобождать нуклеиновые кислоты.

В некоторых случаях мы включаем гранулы олиго DT, если мы хотим связывать и высвобождать конкретно мРНК, например, или гранулы, которые содержат определенные антитела, если мы хотим связывать и высвобождать определенные белки. И мы можем создать колонки извлечения, которые будут делать все эти вещи. Но сегодня мы покажем вам, как сделать колонну для экстракции сасе с помощью гранул кремнезема.

Итак, после того, как мы это сделали, пропустите лизат через колонку с кремнеземом, он работает точно так же, как набор для киогенов в макролаборатории. Затем мы умываемся, чтобы избавиться от всего остального, чего мы не хотим, от всех углеводов, липидов и прочего в клеточном лизате и от остальной части человеческого образца, который нам не нужен. И в самом конце, мы намекаем на воду.

И что хорошо в этих микромасштабных твердофазных экстракционных колонках, так это то, что мы можем элюировать очень небольшим количеством воды, обычно порядка от одного до пяти микролитров. И мы получаем обратно почти все нуклеиновые кислоты, которые мы вводим. У нас есть КПД от 70 до 90%, и первые 10 микролитров, которые мы получаем обратно из этого канала.

Таким образом, если мы дважды промым от двух до 10 микролитров, мы получим обратно почти все нуклеиновые кислоты, которые мы туда положили. Таким образом, это не только чистый образец, который можно использовать с помощью ПЦР, но и образец, который гораздо более концентрирован, чем вы могли бы получить с помощью стандартного настольного набора. Таким образом, конечная цель всех этих методов подготовки образцов состоит в том, чтобы сделать вещи, совместимые с некоторыми другими работами, выполненными людьми.

Очень хорошая работа в полевых условиях, показывающая, что можно проводить ПЦР-амплификацию на чипе. Вы можете провести реакцию обратной транскриптазы на чипе, если вы имеете дело с РНК-вирусом или хотите провести эксперимент по экспрессии генов. Наши методы подготовки образцов могут быть напрямую связаны с ПЦР на чипе, поэтому вам не придется выполнять очистку и подготовку образцов на стенде.

И, а также этап концентрации, который вам нужно будет выполнить, чтобы получить крошечные объемы, необходимые для проведения мультиплексной ПЦР на маленьком чипе. Эксперименты, которые мы покажем вам сегодня, показывают, как мы собираем микрофлюидный чип, который сделан из термопластика, а не из PDMS. Таким образом, это требует немного другого производственного процесса, чем обычно используется, как эти чипы герметизируются.

И затем мы проводим инициируемую светом химию внутри чипа, чтобы создать полимерные монолиты, которые используются как для лизиса клеток, так и для твердофазной экстракции. И в конце этого процесса, который в настоящее время является модульным процессом в лаборатории, но они могут быть интегрированы и были интегрированы, в конце концов вы получаете высококонцентрированный образец нуклеиновых кислот, РНК и ДНК в воде, который затем может быть передан в модуль ПЦР или другой модуль амплификации, где может произойти идентификация микроорганизма или инфекции. Итак, у нас есть грант, над которым мы сейчас работаем, и мы начинаем собирать образцы людей из Бостонского медицинского центра от пациентов, которые могут быть или не могут быть инфицированы гриппом, A.So так как сейчас сезон гриппа, вот образцы, которые мы собираем.

А затем в лаборатории мы проводим золотой стандарт анализа для определения того, инфицирован ли кто-то гриппом А, что, по сути, является культуральным анализом, который занимает несколько дней. И наряду с этим, мы пропускаем эти образцы через наши, прямо сейчас, модули нашего чипа. Итак, мы пропускаем их через колонну лизиса, мы пропускаем их через колонну твердофазной экстракции, а затем мы проводим ПЦР, чтобы увидеть, насколько хорошо мы справляемся по сравнению с методами золотого стандарта.

Так что это та стадия, на которой мы сейчас находимся. Если эти эксперименты увенчаются успехом, я думаю, что в течение следующих четырех-шести лет, возможно, мы окажемся в ситуации, когда у нас будет интегрированный чип и полный анализ на грипп А, а также мы будем работать с образцами Clostridium difficile и кала. И мы, мы, мы также очень близки к тому, чтобы интегрировать не только устройство, но и анализ.

Таким образом, как разработка анализа, так и проектирование чипа должны происходить рука об руку. Так что для конкретного применения, попадание к постели больного, это действительно целенаправленный процесс. Вы должны знать, знаете, с какого образца вы начинаете, и микроорганизм, который вы ищете, чтобы оптимизировать чип для использования у постели больного.

Так что я не думаю, что мы так уж далеки от того, чтобы сделать это прототипом. Это наши конечные цели, поэтому я надеюсь, что мы их достигнем.