Микрожидкостных Заявки на одноразовые диагностики

Меня зовут Кэтрин Клаудбридж, я профессор в области производства, инженерного дела и биомедицинской инженерии в Бостонском университете. Также я являюсь директором Лаборатории биомедицинских микроустройств и микросред. Мы работаем преимущественно над созданием одноразовых диагностических систем для применения в условиях ограниченных ресурсов.

Для создания этих устройств мы используем микрофлюидику. Нас интересуют две области исследования. В первую очередь мы стремимся изучить, как биомолекулы и клетки взаимодействуют с поверхностями пластиковых полимеров.

Это наше основное направление. Данная работа воплощена в микрофлюидных приложениях для одноразовой диагностики. Таким образом, в лаборатории мы создаем микрофлюидные устройства.

В отличие от термопластичных материалов, обычно используют PDMS — эластомер, который чаще всего применяется для создания микрофлюидных устройств в лабораторных условиях. Мы же изготавливаем наши устройства из термопластов. Наша цель — использовать такие термопластичные устройства для проведения молекулярно-биологических исследований в микромасштабе таким образом, чтобы эти исследования можно было проводить в полевых условиях, вдали от централизованной лаборатории.

На практике в лаборатории это реализуется следующим образом: мы создаем небольшие пластиковые картриджи, внутри которых расположены колонки для твердофазной экстракции, лизиса клеток или смешивания. В качестве метода детекции мы также используем полимеразную цепную реакцию на чипе. Все эти элементы интегрированы в компактное устройство, которое в долгосрочной перспективе исследований станет портативным прибором, пригодным для использования в полевых условиях или в ситуациях, когда доступ к полноценной лаборатории с соответствующими центрифугами, инкубаторами и другим оборудованием невозможен.

В идеале мы хотели бы начать с образца человеческого материала, например, крови, мочи, кала или назофарингеального мазка, который представляет собой слизь. На выходе из чипа мы должны получить ответ — да или нет — инфицирован ли человек конкретным микроорганизмом. Это достигается путем поиска ДНК или РНК данного конкретного микроорганизма в образце пациента, в зависимости от вида возбудителя.

Таким образом, основные технические сложности возникают преимущественно на этапе подготовки проб. Когда вы начинаете с анализа крови, кала или мочи, вам необходимо перейти от состояния загрязненного биологического образца человека, содержащего множество потенциальных взвешенных частиц или ингибиторов ПЦР и других методов амплификации, к получению в итоге очень чистого элюированного образца нуклеиновых кислот. Затем этот образец можно использовать для амплификации или поиска конкретной ДНК или РНК, которая позволит определить, присутствовал ли в пробе искомый микроорганизм.

Таким образом, для очистки этих образцов необходимо выполнить несколько действий. Во-первых, образец нужно отфильтровать; в зависимости от типа образца это может включать грубую фильтрацию или короткое центрифугирование перед нанесением образца на чип. Мы всегда стараемся начинать работу с образцами в том виде, в котором они поступают от клинициста.

Таким образом, при работе с образцами мочи, кала и назофарингеальными мазками наша цель состоит в том, чтобы клиницист выполнял свою работу в обычном режиме и производил забор образца стандартным способом. Затем мы берем этот образец и наносим его на чипы. Следовательно, если на данном этапе потребуется дополнительная фильтрация, она будет происходить непосредственно в чипе.

Второй этап включает в себя лизис клеток и микроорганизмов, присутствующих в образце, поскольку мы проводим молекулярный анализ. Таким образом, мы выполняем стадию лизиса, которая обычно заключается в пропускании образца через фильтр с малым размером пор. Иногда такой фильтр содержит наночастицы, например, углеродные нанотрубки, которые имеют острые края; они могут использоваться для разрушения организмов с более прочными клеточными стенками, таких как C difficile — грамположительная бактерия, с которой мы работаем и которую очень трудно подвергнуть лизису.

Таким образом, нам необходимы более эффективные колонки для лизиса. Обычно мы выполняем комбинированный химический и механический лизис внутри чипа. После этого наша цель — взять лизат и выделить из него очищенные нуклеиновые кислоты.

Таким образом, мы пропускаем лизат через колонку для твердофазной экстракции, интегрированную в микрофлюидный чип. Эта колонка для твердофазной экстракции изготовлена из пластика с помощью фотоинициируемого синтеза внутри микрофлюидного канала после его изготовления. Также она обычно импрегнирована частицами силикагеля, поскольку нам необходимо связать и затем высвободить нуклеиновые кислоты.

В некоторых случаях мы использовали олиго-dT-гранулы, например, если нам нужно было специфически связывать и высвобождать мРНК, или гранулы с определенными антителами, если требовалось связывать и высвобождать конкретные белки. Мы также можем создавать экстракционные колонки, выполняющие все эти функции. Однако сегодня мы покажем вам, как изготовить колонку для экстракции оснований с использованием силикатных гранул.

После этого пропустите лизат через силикажную колонку; она работает так же, как набор Qiagen в макромасштабной лаборатории. Затем проведите промывку, чтобы удалить все нежелательные компоненты: углеводы, липиды и другие примеси из клеточного лизата и остальной части образца человека. В самом конце выполняется элюция водой.

Преимуществом этих микромасштабных колонок для твердофазной экстракции является то, что элюцию можно проводить очень малым количеством воды, обычно в диапазоне от 1 до 5 µL. При этом мы восстанавливаем почти все введенные нуклеиновые кислоты. Эффективность составляет около 70–90% для первых 10 µL элюата, полученного из этого канала.

Таким образом, если мы проведем две промывки по 2–10 µL, мы восстановим почти все внесенные нуклеиновые кислоты. В итоге мы получаем не только чистый образец, пригодный для ПЦР, но и образец с гораздо более высокой концентрацией, чем можно было бы достичь с помощью стандартного настольного набора. Конечная цель всех этих методов подготовки проб заключается в том, чтобы сделать результаты совместимыми с другими исследованиями, проведенными специалистами в данной области.

Очень качественная работа в данной области, демонстрирующая возможность проведения ПЦР-амплификации на чипе. Если вы работаете с РНК-вирусом или хотите провести эксперимент по экспрессии генов, реакцию обратной транскрипции также можно осуществить на чипе. Наши методы подготовки проб могут быть напрямую сопряжены с ПЦР на чипе, что избавляет от необходимости проводить очистку и подготовку образцов вручную на лабораторном столе.

А также этап концентрирования, который необходим для получения сверхмалых объемов, требуемых для проведения мультиплексной ПЦР на небольшом чипе. Таким образом, в экспериментах, которые мы продемонстрируем сегодня, будет показано, как мы собираем микрофлюидный чип, изготовленный из термопластика, а не из ПДМС. Следовательно, он требует несколько иного процесса изготовления и герметизации, чем обычно используется для таких чипов.

Затем мы проводим химическую реакцию с фотоинициацией внутри чипа для создания полимерных монолитов, которые используются как для лизиса клеток, так и для твердофазной экстракции. В результате этого процесса, который в настоящее время представляет собой набор модульных лабораторных процедур, но может быть и уже был интегрирован, вы получаете высококонцентрированный образец нуклеиновых кислот, РНК и ДНК в воде. Затем этот образец может быть направлен в модуль ПЦР или другой модуль амплификации для идентификации микроорганизма или инфекции. В настоящее время мы работаем над грантом в рамках которого начинаем собирать образцы людей в Медицинском центре Бостона от пациентов, которые могут быть или не быть инфицированы гриппом A. Поскольку сейчас сезон гриппа, мы собираем именно такие образцы.

Затем в лаборатории мы проводим контрольные анализы («золотой стандарт»), чтобы определить, инфицирован ли человек гриппом A; по сути, это метод посева, который занимает несколько дней. Параллельно с этим мы пропускаем эти образцы через модули нашего чипа. Мы пропускаем их через колонку для лизиса, затем через колонку для твердофазной экстракции, после чего проводим ПЦР, чтобы оценить эффективность нашего метода в сравнении со стандартными методами анализа.

Таким образом, на данном этапе мы находимся в этой точке. Если эти эксперименты увенчаются успехом, я полагаю, что в течение следующих четырех-шести лет мы, возможно, придем к ситуации, когда у нас будет интегрированный чип и полноценный анализ для определения гриппа А; также мы работаем над анализом образцов кала на наличие Clostridium difficile. Кроме того, мы очень близки к тому, чтобы интегрировать не только само устройство, но и сам метод анализа.

Таким образом, разработка анализа и проектирование чипа должны идти рука об руку. Следовательно, для конкретного применения, направленного на использование в клинической практике, это действительно процесс, ориентированный на цель. Вы должны знать исходный образец и микроорганизм, который вы ищете, чтобы оптимизировать чип для использования у постели больного.

Таким образом, я полагаю, что мы уже достаточно близки к созданию прототипа для реализации этого. Таковы наши конечные цели, и я надеюсь, что мы их достигнем.