Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

Здравствуйте, я Джерси. Привет, меня зовут Шаби, мы оба — постдокторанты Имперского колледжа Лондона, работающие под руководством профессора Эндрю Ди Мело и доктора Джоша Дела над микрофлюидными капельными платформами. Микрофлюидные платформы на основе капель являются перспективными кандидатами для проведения экспериментов с более высокой пропускной способностью, так как капли могут создаваться с очень высокими, точно определенными объемами, а частота их генерации может достигать нескольких тысяч в секунду.

Кроме того, поскольку исследуемая область может быть инкапсулирована в компартменты объемом всего несколько литров, можно исключить перекрестные помехи и дисперсию, а аналитические процессы можно синхронизировать с большей точностью. В нашей группе мы уже успешно внедрили платформы на основе микрокапель во множество приложений. Например, для полимеразной цепной реакции, синтеза наночастиц и анализа единичных молекул в клетке.

Большие объемы информации, генерируемые этими системами, должны эффективно извлекаться, обрабатываться и использоваться. В связи с этим, выбранный метод детектирования должен быть подходящим, обладать высокой чувствительностью и низкими пределами обнаружения, быть применимым к различным молекулярным видам, быть неразрушающим и иметь возможность простой интеграции с микрофлюидными устройствами. Для решения этой задачи мы разработали набор экспериментальных инструментов и протоколов, которые позволяют извлекать большие объемы физической информации из сред с малым объемом и применимы для анализа широкого спектра физических, химических и биологических объектов.

В данном протоколе мы представим два метода, которые применяются для детектирования одиночных клеток и картирования процессов смешивания в Dropbox. Микрофлюидные чипы традиционно изготавливают из полидиметилсилоксана (PDMS) с использованием методов фотолитографии. Этот процесс следует проводить в чистом помещении для получения микрофлюидных каналов. На кремниевую подложку наносят спинометрально SU-8 50, затем проводят мягкий обжиг на нагревательном планшете при 65 °C и 95 °C для испарения растворителя и уплотнения пленки. После охлаждения резист SU-8 подвергают воздействию УФ-излучения через соответствующую маску, затем обжигают подложку при 65 °C и 95 °C после последующего охлаждения.

Проявите незасвеченные области, используя подходящий проявитель и перемешивая раствор. Промойте пластину свежим растворителем EC, затем высушите её струей газа для получения чистой поверхности. Обработайте пластину промывками гексаном и метанолом.

Для завершения процесса изготовления мастер-формы для эстата нанесите методом испарения фиксирующий агент на поверхность в эксикаторе в течение 40 минут. Для формирования структурированных микрофлюидных подложек смешайте S guard 1 8 4 в соотношении смолы к сшивающему агенту 10:1 и нанесите этот раствор на мастер-форму. Удалите пузырьки воздуха в эксикаторе и проведите полимеризацию устройства при температуре 65 °C.

Вырежьте отвержденный PDMS и отделите его от мастер-формы. С помощью биопсийного просекателя создайте отверстия для подключения жидкостных трубок. Отверждайте следующий слой PDMS в течение 20 минут при 65 °C.

Поместите подготовленный верхний слой на нижний и подвергните отверждению в течение ночи при 65 °C. Отделите чипы от чашки Петри и нарежьте на кубики. После изготовления чипы готовы к использованию путем введения соответствующих растворов.

Заполните шприцы необходимыми растворами, убедившись, что в трубках не осталось пузырьков воздуха. Для генерации капель используются две фазы. Водная дисперсная фаза содержит интересующие реагенты.

Масляная фаза служит непрерывной фазой. На один конец трубки того же внутреннего диаметра, что и кончики игл шприцев, закрепите иглы, установите шприцы на шприцевой насос и задайте необходимую скорость потока. Для каждой фазы рекомендуется поддерживать минимальное соотношение скоростей потоков масла и водной фазы, равное единице, чтобы избежать смачивания PDMS водной фазой, что привело бы к нестабильному формированию капель. Подсоедините другие концы трубок непосредственно к отверстиям, пробитым в подложке из PDMS.

Для более сложных решений могут быть использованы кварц, капиллярные порты или соединители. Подсоедините выходной порт чипа к трубке и направьте её в коллектор для сбора отходов или дальнейшего анализа. После завершения настройки можно использовать две основные конфигурации микроканалов для генерации капель: фокусировку потока или Т-образный соединитель; в обоих случаях разделение происходит за счет сил сдвига, возникающих при соединении двух несмешивающихся жидкостей в данных геометрияях, и последующего развития капиллярной нестабильности на границе раздела фаз.

Спонтанно генерируются отдельные диспергированные капли объемом всего несколько фемтолитров. После генерации капель их можно исследовать с помощью оптической установки. Оптическая система настраивается согласно следующему протоколу.

Используйте конфокальный микроскоп с функцией автоматического субмикронного позиционирования и лазер, работающий на длине волны, соответствующей спектру поглощения используемых флуорофоров. Для их возбуждения при проведении визуализации времени жизни флуоресценции используйте импульсный лазер с частотой повторения импульсов в несколько мегагерц. В экспериментах с мокротой используются управляющие зеркала и оптика для контроля высоты и направления луча.

Используйте дихроичное зеркало для отражения лазерного луча в объектив. При одновременном использовании двух лазеров можно установить двухдиапазонное дихроичное зеркало. Для обеспечения отражения двух лазерных лучей используйте микроскопический объектив с бесконечной коррекцией и высокой числовой апертурой NA, чтобы сфокусировать лазерный свет в узкий пучок внутри микрофлюидного канала.

Соберите флуоресценцию, излучаемую образцом внутри микрофлюидного канала, используя тот же объектив с высокой NA и пропуская ее через то же дихроичное зеркало. Удалите остаточный возбуждающий свет с помощью однополосного или двухполосного эмиссионного фильтра. Сфокусируйте эмиссионную флуоресценцию на диафрагме с отверстием 75 micrometer.

Используйте плосковыпуклую линзу. Расположите диафрагму в конфокальной плоскости объектива микроскопа. Используйте еще одно дихроичное зеркало, чтобы разделить флуоресцентный сигнал на два детектора.

Отфильтруйте флуоресценцию, отраженную дихроичным зеркалом, с помощью эмиссионного фильтра и сфокусируйте ее плоско-выпуклой линзой на первый детектор. Для экспериментов с использованием вторичного красного флуорофора отфильтруйте флуоресценцию, прошедшую через дихроичное зеркало, с помощью другого эмиссионного фильтра, а затем сфокусируйте ее с помощью другой плоско-выпуклой линзы на второй детектор. Для регистрации фотонов флуоресценции используйте лавинные фотодиоды.

Для сбора данных флуоресценции подсоедините электронный сигнал от детектора на базе лавинного фотодиода к многофункциональному устройству сбора данных (DAQ) для регистрации данных на персональном компьютере. Для экспериментов с мокротой используйте импульсный лазер и подключите детекторы к плате TCSPC (подсчет единичных фотонов с временным разрешением), установленной в отдельном ПК. Эта плата позволяет получать данные о времени жизни флуоресценции.

Используется методика TCS PC. Каждый зарегистрированный флуоресцентный фотон соотносится с падающим лазерным импульсом, и таким образом каждому испущенному флуоресцентному фотону присваивается время задержки. Эти данные можно аппроксимировать одной или несколькими экспоненциальными кривыми затухания для получения оценки скорости излучения флуорофоров.

В настоящее время известно, что клетки крайне гетерогенны с биологической, физической и химической точек зрения. Следовательно, в идеале следует анализировать каждую клетку в отдельности. Однако анализы должны проводиться с высокой пропускной способностью, чтобы можно было собрать достаточное количество количественной информации для получения достоверного и значимого вывода.

Ниже представлен пример инкапсуляции клеток e coli в отдельные капли для проведения данного процесса. Используйте штамм e coli top 10, который культивировали в течение ночи. Для определения жизнеспособности клеток используйте cyto nine и пропидий иодид.

Оба красителя являются интеркалирующими красителями ДНК, и интенсивность их флуоресценции возрастает более чем в 20 раз. При связывании с ДНК SYTO 9 представляет собой зеленый флуоресцентный краситель, проникающий через мембраны, а пропидий йодид — красный флуоресцентный краситель, который не проникает через мембраны.

Таким образом, живые клетки флуоресцируют зеленым, в то время как мертвые клетки демонстрируют как зеленое, так и красное излучение. Здесь показан процесс генерации капель и инкапсуляция одной клетки с помощью Т-образного соединения. Данное видео было записано на высокоскоростную камеру, однако скорость генерации капель может достигать нескольких тысяч в секунду.

При инкапсуляции клеток необходимо убедиться, что культура клеток разбавлена таким образом, чтобы количество клеток было меньше количества генерируемых капель, а также предотвратить седиментацию клеток, которая может произойти в шприце или трубках. Используйте магнитный стержень-мешалку внутри шприца, чтобы поддерживать равномерное распределение клеток в растворе. Для соединения шприца с микрочипом используйте очень тонкие трубки диаметром 50 micrometers.

Это обеспечивает высокую скорость потока внутри трубки и, следовательно, предотвращает седиментацию клеток. Ниже приведены типичные примеры графиков количества фотонов в зависимости от времени для экспериментов с использованием клеток. Для картирования процессов смешивания внутри капель.

Капли могут быть созданы с использованием двух различных флуорофоров с разным временем жизни. Внутри движущейся капли создается поле потока, которое в конечном итоге смешивает два изначально разделенных раствора для усиления процесса перемешивания. Симметрия поля потока может быть изменена путем использования извилистых каналов.

Для анализа капель сфокусируйте объем оптического зондирования на половине высоты микроканала, по которому перемещаются капли; начиная с одного края канала, проведите каждый эксперимент по всей его ширине с интервалом в один микрометр. Реализуйте алгоритм для дифференциации одиночных всплесков, связанных с каплями, от шумового фона масляной фазы, а также для определения длительности каждого всплеска.

Реализуйте второй алгоритм для извлечения значений времени задержки и интенсивности по всей длине каждой капли при конкретной ширине, при которой проводился эксперимент. Затем используйте алгоритм метода максимального правдоподобия (MLE) для оценки времени жизни флуоресценции каждой капли в эксперименте. Усреднение значений времени жизни для всех капель в эксперименте позволяет снизить конечную погрешность вычислений методом MLE.

Чем больше исследуется капель, тем меньше ошибка после получения траектории времени жизни. Для каждой ширины объедините все траектории на 2D-карте. Поскольку каждое значение времени жизни связано с определенным соотношением двух типов флоры, таким образом можно получить карту концентраций или смешивания.

Мы описали изготовление микроустройства, экспериментальную установку и соответствующие протоколы для формирования микрокапель, инкапсуляции областей и оптического детектирования этого процесса — самих капель. В качестве двух примеров были выбраны детектирование одиночных клеток в каплях и картирование процессов смешивания внутри текущей капли, что представляет собой типичные области применения, которые в настоящее время исследуются с помощью капельной микрофлюидики.

Как показывают представленные эксперименты, использование капельных микрофлюидных платформ обладает рядом привлекательных характеристик, таких как высокая пропускная способность за счет идеального ограничения объема и более высокая воспроизводимость. Большой объем генерируемой информации и высокая скорость ее получения требуют применения методов быстрого детектирования с максимально высоким пространственно-временным разрешением, чтобы в полной мере использовать преимущества этих миниатюрных платформ.

В данном случае мы демонстрируем, что это возможно с использованием высокоточных методов фторной спектроскопии.