Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

Здравствуйте, меня зовут Джерси. Здравствуйте, меня зовут Шаби, и мы оба являемся постдокторантами в Имперском колледже Лондона, работаем с профессором Эндрю Ди Мело и доктором Джошем Делом над микрофлюидными капельными платформами. Микрофлюидные платформы на основе капель являются перспективными кандидатами для экспериментов с более высокой пропускной способностью, поскольку они могут быть сгенерированы в очень высоких, точно определенных объемах, а их конкуренты, частота генерации может достигать нескольких килограммов.

Кроме того, поскольку интересующая область может быть инкапсулирована в отсеки уже на несколько литров, можно устранить как перекрестные помехи, так и дисперсию, а аналитические процессы могут быть синхронизированы с большей точностью. В нашей группе мы уже успешно внедрили платформы микрокапель во многие приложения. Например, полимеразная цепная реакция, синтез наночастиц и анализ одной молекулярной клетки.

Большие объемы информации, генерируемой в этих системах, должны быть эффективно извлечены, освоены и использованы. В этом отношении выбранный метод детектирования должен быть правильным, обеспечивать высокую чувствительность и низкие пределы детектирования, быть применимым к ряду молекулярных веществ, быть неразрушающим и легко интегрироваться с микрофлюидными устройствами. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали набор экспериментальных инструментов и протоколов, которые позволяют извлекать большие объемы физической информации из небольших объемов окружающей среды и применимы для анализа широкого спектра физических, химических и биологических процессов.

В этом протоколе мы представим методы, которые применяются для обнаружения одиночных клеток и отображения процессов смешивания в Dropbox. Микрофлюидные чипы традиционно изготавливаются из полидиметилслоунских МПГ с использованием методов фотолитографии. Этот процесс должен быть проведен в чистом помещении установки для получения микрофлюидных каналов Spinco, SU eight 50 на кремниевой пластине, мягкой выпечки на горячей плите при температуре 65 градусов и 95 градусов для испарения растворителя и для уплотнения пленки после охлаждения, выдержки SU eight, противостояния ультрафиолетовому излучению под соответствующей маской, А затем выпекать при 65 градусах и 95 градусах после остывания.

Обработайте неоткрытые участки с помощью соответствующего проявляющего раствора во время помешивания. Используйте свежий растворитель EC для промывки пластины, а затем высушите ее под газом, чтобы получить чистую поверхность. Обработайте гексаном и метанолом.

Кроме того, чтобы завершить процесс изготовления эсате, выпарьте захватывающий агент на поверхность в виде влагопоглотителя в течение 40 минут. Чтобы сформировать структурированные микрофлюидные субстраты, мы смешиваем S guard 1 8 4 в соотношении 10 к одному сшивающего агента смолы и натягиваем его на мастер. Дегазируйте его в дегазации и отверждайте устройство при 65 градусах.

Отвержденный ПДМС срезаем и снимаем с мастера. Создайте отверстия для доступа к жидкостным трубкам с помощью пуансона для биопсии. Отверждайте еще один слой PDMS в течение 20 минут при температуре 65 градусов.

Подготовленный верхний слой выложите на нижний слой и засушите в течение ночи при температуре 65 градусов. Очистите чипсы от чашки Петри и нарежьте кубиками. После того, как чипы изготовлены, они готовы к использованию путем внедрения интересующих их решений.

Наполните шприцы необходимыми растворами, следя за тем, чтобы ни в одной части трубки не осталось пузырьков воздуха. Для генерации капель используются две фазы. Водная дисперсная фаза содержит реагенты, представляющие интерес.

Масляная фаза действует как трубка с непрерывной фазой, подходящая к тому же внутреннему диаметру, что и у шприца, наконечники игл на одном конце игл монтируют шприцы на шприцевой насос и определяют желаемую скорость потока введения. Для каждой фазы рекомендуется минимальное соотношение расхода масла в воде, равное единице, чтобы избежать смачивания PDMS водной фазой, что привело бы к нестабильному образованию капель. Подсоедините другие концы трубки непосредственно к отверстиям, пробитым в подложке PDMS.

Для более сложных решений также могут быть реализованы диоксид кремния, капиллярные порты или разъемы. Подсоедините выходное отверстие чипа к трубке и направьте его в коллектор для сбора отходов или дальнейшей обработки анализа. После того, как это настроено, существуют две основные конфигурации микроканалов для фокусировки потока капель или формат Т-образного перехода в результате сил, возникающих при использовании этих геометрий для объединения двух допустимых жидкостей, и последующих капиллярных входов, которые развиваются в интерфейсе.

Одна дисперсная капля размером в несколько фемтолитров образуется спонтанно. После того, как капли генерируются, их можно зондировать с помощью оптической установки. Оптическая система настраивается по следующему протоколу.

Используйте конфокальный микроскоп с автоматической субмикронной способностью позиционирования и лазер, работающий на длине волны, которая соответствует поглощению задействованных флюористых капель. Чтобы возбудить их, используйте импульсный лазер, работающий с частотой следования в несколько мегагерц для флуоресцентной визуализации в течение всего срока службы. В экспериментах с флегмой используются зеркала управления лучом и оптика для управления высотой луча, а также направлением луча.

Используйте дихроичное зеркало, чтобы отразить лазерный луч в линзу объектива. Если одновременно используются два лазера, можно установить двухполосное зеркало diic. Чтобы обеспечить отражение двух лазерных лучей, используйте объектив микроскопа NA с высокой числовой апертурой и коррекцией на бесконечность, чтобы сфокусировать лазерный свет в микрофлюидном канале.

Соберите флуоресценцию, излучаемую образцом в микрофлюидном канале, используя тот же объектив с высоким уровнем NA и пропуская через то же дихроичное зеркало. Удалите остаточную лампу возбуждения с помощью однополосного или двухполосного фильтра излучения. Сфокусируйте флуоресцентное излучение на точечном отверстии 75 микрометров.

Использование плоской выпуклой линзы. Расположите отверстие в конфокальной плоскости объектива микроскопа. Используйте другое дихроичное зеркало, чтобы разделить флуоресцентный сигнал на два детектора.

Отфильтруйте флуоресценцию, отраженную дихроичным зеркалом, с помощью эмиссионного фильтра и сфокусируйте ее с помощью простой выпуклой линзы на первом детекторе. Для экспериментов с участием вторичного красного флуоресценции отфильтруйте флуоресценцию, проходящую через зеркало diic, с помощью другого эмиссионного фильтра, а затем сфокусируйте ее с помощью другой плоской выпуклой линзы на втором детекторе. Используйте лавинные фотодиоды для детектирования флуоресцентных фотонов.

Для получения флуоресцентных данных необходимо подключить электронный сигнал от лавинного фотодиодного детектора к многофункциональному устройству сбора данных для регистрации данных, работающему на персональном компьютере. Для экспериментов с мокротой используйте импульсный лазер и подключите детекторы к коррелированной по времени однофотонной карте TCS PC, работающей на отдельном компьютере. Эта карта позволяет получать данные о сроке службы флуоресцентной лампы.

Использование методологии TCS PC. Каждый обнаруженный флуоресцентный фотон коррелирует с падающим лазерным импульсом, и поэтому каждому испускаемому флуоресцентному фотону назначается время задержки. Эти данные могут быть подогнаны к одной или множественной экспоненциальной кривой затухания, чтобы получить оценку скорости излучения флуорофоров.

Теперь мы знаем, что клетки очень неоднородны как с биологической, так и с физической и химической точки зрения. Поэтому, в идеале, мы должны анализировать каждую клетку за раз. Тем не менее, анализы должны выполняться с более высокой производительностью, чтобы мы могли собрать достаточно количественной информации для того, чтобы прийти к надежному и значимому выводу.

Здесь у нас есть пример инкапсуляции клеток кишечной палочки в одну каплю, чтобы ее можно было выполнить. Используйте 10 лучших сортов кишечной палочки, которые были культивированы за ночь. Для того чтобы выявить жизнеспособность клеток, используют цитон 9 и йодид пропидия.

Оба красителя являются ДНК-интерколляционными красителями, и интенсивность их флуоресценции увеличивается более чем в 20 раз. При связывании с ДНК cyto nine образует зеленый флуоресцентный краситель, который проницаем для мембран и йодид пропидия. Это красный флуоресцентный краситель, который непроницаем для мембран

Таким образом, живые клетки флуоресцируют зеленым цветом, в то время как мертвые клетки излучают как зеленый, так и красный цвет. Здесь мы видим генерацию капель и инкапсуляцию одной ячейки с Т-образным переходом. Это видео было записано высокоскоростной камерой, но капли могут образовываться со скоростью тысячи в секунду.

При инкапсуляции клеток необходимо убедиться в том, что культура клеток разбавлена таким образом, чтобы в ней оставалось меньше клеток, чем образуются капли, что клетки не допускаются оседания, которое может произойти в шприце или трубке. Используйте магнитную мешалку внутри шприца, чтобы клетки равномерно распределились в растворе. Используйте очень тонкую трубку, 50 микрометров, чтобы подсоединить шприц к микрочипу.

Это обеспечивает высокую скорость потока внутри трубки и, следовательно, предотвращает осаждение клеток. Вот типичные примеры подсчета фотографий в зависимости от времени для экспериментов на клетках. Для отображения процессов смешивания в каплях.

Капли могут быть сгенерированы с помощью двух разных флюорочетверов с разным временем жизни. Внутри текущей капли создается поле потока, которое в конечном итоге смешивает два первоначально разделенных раствора для улучшения процесса смешивания. Симметрия поля потока может быть изменена с помощью извилистых каналов.

Для того, чтобы зондировать капли, сфокусируйте объем оптического зонда на половине высоты микроканала, по которому текут капли, начиная с одной стороны канала, проводите каждый эксперимент по всей ширине канала. С интервалом в один микрометр. Реализуйте алгоритм для дифференциации одиночных всплесков, связанных с каплями, от шумового фона масляной фазы, а также для определения продолжительности каждого всплеска.

Реализуйте второй алгоритм для извлечения значений времени и интенсивности задержки по длине каждой капли на определенной ширине, где проводился эксперимент. Затем используйте алгоритм оценки максимального правдоподобия MLE для оценки времени жизни флуоресценции каждой капли в эксперименте. Усреднение значений времени жизни для всех капель в эксперименте уменьшает итоговую ошибку вычисления MLE.

Чем больше капель исследовано, тем меньше ошибка после того, как была получена траектория на всю жизнь. Для каждой ширины объедините все траектории в 2D-карте. Поскольку каждая пожизненная величина связана с определенной смесью двух четырех флор, таким образом, можно получить карту концентрации или смешивания.

Мы описали изготовление микроустройства и экспериментальную установку и связанные с ней протоколы для формирования микрокапель, инкапсуляции области и оптического детектирования процесса, капель. В двух примерах было выбрано обнаружение одиночных клеток в каплях и картирование процессов смешивания. Внутри текущей капли представлены общие области применения, которые в настоящее время исследуются с помощью микрофлюидики капель.

Как показывают представленные эксперименты, использование капельных микрофлюидных платформ обладает определенными привлекательными характеристиками, такими как высокая пропускная способность, идеальная локализация и более высокая воспроизводимость. Большой объем производимой информации и высочайшая скорость, с которой эта информация генерируется. DU требовал использования быстрых методов обнаружения с высочайшим пространственно-временным разрешением, чтобы получить все преимущества от этой миниатюрной платформы.

В данном случае мы демонстрируем, что это возможно с помощью высокоточных методов флуорной спектроскопии.