Трансплантация биоинженерного легкого с использованием децеллюляризованных легких мыши и первичных эндотелиальных клеток человека

Биоинженерия органов человеческого размера требует большого количества ресурсов, которые часто превышают возможности академических лабораторий. Снижение стоимости разработки итерационных протоколов ускорит прогресс исследований в этой области. Целью данного исследования является создание стандартизированного протокола биоинженерии легких с использованием мышиных блокад сердца-легких. До сих пор неизвестно, какие клетки подходят для органной биоинженерии и как эти клетки должны быть интегрированы в культуру органного биореактора. Необходимо сравнить несколько типов ячеек и условий, чтобы создать масштабируемые и воспроизводимые протоколы.

Мыши — маленькие и простые в обращении подопытные животные. Однако, несмотря на небольшие размеры, основная архитектура легких у млекопитающих одинакова. Оптимизируя протокол на этой небольшой платформе, мы можем масштабировать лазерные модели животных, просто умножая оптимизированные результаты в соответствии с размером животных. Эта платформа биоинженерии легких размером с мышь позволяет исследователям эффективно тестировать свои стволовые клетки. Эти генетически модифицированные клетки могут быть ценными или дорогими для использования в инженерии легких в целом. Кроме того, клетки, полученные от пациента, также могут быть использованы для создания моделей заболеваний in vitro.

В настоящее время предпринимаются испытания нескольких типов сконструированных стволовых клеток и клеток-предшественников, чтобы выяснить необходимый потенциал пролиферации и дифференциальную способность для биоинженерии легких. Как только подходящие клетки будут идентифицированы, это исследование будет распространено на более крупную животную модель, такую как свиньи.

[Рассказчик] Для начала поместите усыпленную мышь в лежачее положение на операционный стол и зафиксируйте конечности. Равномерно распылите 70% этанол на грудь и брюшную поверхность для ее стерилизации. Далее с помощью ножниц из нержавеющей стали вскройте брюшную полость по срединной линии, идущей к шее, и расщепите грудину. Резекция диафрагмы от грудной стенки. Разрежьте брюшную стенку грудной клетки, чтобы обнажить грудные полости и удалить тимус. С помощью шелкового шва 4/0 легайте нижнюю полую вену и правую верхнюю полую вену. Разрежьте брюшную аорту нержавеющими ножницами для дренирования. С помощью стерильного шприца объемом пять миллилитров, оснащенного иглой 27 калибра, введите три миллилитра стерильного PBS в правый желудочек путем прокола стенки желудочка. С помощью щипцов Дюмона наложите шелковый шов 4/0 вокруг основной легочной артерии. Затем с помощью пружинных ножниц прорежьте двухмиллиметровое окно под клапанами легочной артерии для доступа к стенке правого желудочка. Вставьте катетер легочной артерии через окно и закрепите его предварительно запетленным шелковым швом 4/0. Медленно введите два миллилитра PBS через катетер легочной артерии с помощью пятимиллилитрового шприца. Канюлеируйте трахею с помощью трахейного катетера и завяжите ее на месте шелковым швом 4/0. Теперь медленно введите два миллилитра воздуха через трахейный катетер с помощью пустого пятимиллилитрового шприца. Подержите воздух в течение 10 секунд, чтобы предотвратить утечку воздуха из легких. Удалите концевую блокаду сердца и легких. Затем перенесите резецированный блок сердца-легких в пластиковую чашку Петри диаметром 10 сантиметров, содержащую деионизированную воду, для децеллюляризации легких. Выдержите блок в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации с помощью пятимиллилитрового шприца трижды ввести два миллилитра стерильной деионизированной воды через трахейный катетер. Делайте паузу после каждой инъекции, чтобы дать жидкости выйти по мере того, как легкие отшатываются. Аналогично введите два миллилитра воды через катетер легочной артерии. Введите два миллилитра 0,1% раствора Triton X-100 в катетеры трахеи и легочной артерии. Перенесите блок искусственного кровообращения в чашку Петри и статически инкубируйте в растворе Triton X-100 в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день, чтобы удалить раствор Triton X-100 из легких, введите два миллилитра деионизированной воды в катетер трахеи и катетер легочной артерии и повторите это с двумя миллилитрами 2% раствора дезоксихолата. После удаления раствора дезоксихолата из легких введите по два миллилитра одного молярного раствора хлорида натрия в катетеры трахеи и легочной артерии. Инкубируйте блок искусственного кровообращения в течение одного часа. После удаления раствора хлорида натрия деионизированной водой введите два миллилитра рабочего раствора DNase I в катетеры трахеи и легочной артерии. Инкубируйте блок искусственного кровообращения в течение одного часа. Введите стерильный PBS в катетеры трахеи и легочной артерии, чтобы удалить раствор ДНКазы I. После децеллюляризации подтвердите, что легкие белые и прозрачные по краям. Добавьте 70 миллилитров питательной среды для эндотелиальных клеток 2, или EGM-2, в стеклянную канистру и поместите силиконовую пробку на верхнюю часть канистры, чтобы запечатать ее. Соберите силиконовую пробку, стеклянную канистру, винтовую крышку GL45 с трубкой, автоклавируемую стеклянную бутылку объемом 250 миллилитров и трубку L/S 14 с приманочными фитингами с помощью трехсторонних запорных кранов. Вставьте иглу 20 калибра в силиконовую перегородку завинчивающейся крышки GL45. Заполните трубки А, В и С питательной средой с помощью 10-миллилитрового шприца, подключенного к запорным кранам номер один и три. Прикрепите катетер легочной артерии децеллюляризованного блока искусственного кровообращения к трубке C с помощью приманочного фитинга. Убедитесь, что в катетере или трубке нет пузырьков воздуха. Для гравитационной инъекции эндотелиальных клеток поместите клеточный резервуар, содержащий эндотелиальные клетки пупочной вены человека, или HUVECs, на магнитную мешалку, следя за тем, чтобы резервуар находился на 30 сантиметров выше камеры органа. Включите магнитную мешалку со скоростью 120 об/мин. Откройте запорные краны один и два, чтобы позволить клеточной суспензии течь в децеллюляризованный каркас через трубку А, трубку С и катетер легочной артерии. Для перфузии культуры органов поместите камеру органа в инкубатор с углекислым газом. Прикрепите трубку B к головке насоса, подключенной к пульсирующему насосу. Закройте стеклянную дверцу инкубатора. Убедитесь, что трубка правильно расположена между дверью и резиновым уплотнителем. Инкубируйте децеллюляризованный каркас при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов, чтобы эндотелиальные клетки могли осесть внутри каркаса. Запускайте насос со скоростью шесть об/мин, что приводит к перфузии среды объемом два миллилитра в минуту с использованием трубки L/S 14. Наблюдайте, как децеллюляризированное легкое слегка расширяется из-за перфузии среды. Затем закройте дверцу инкубатора. Чтобы выполнить замену среды, остановите привод насоса. Присоедините к трем запорным кранам стерильный шприц объемом 50 миллилитров, и извлеките из камеры 50 миллилитров среды. Наполните еще 50-миллилитровый стерильный шприц 50 миллилитрами предварительно подогретой среды. Введите раствор в стеклянную канистру и переместите среду в камеру с помощью третьего запорного крана, убедившись, что запорный кран включен правильно. Перезапустите пульсирующий насос. Соберите рекуллюляризированный блок сердца и легких после двух дней перфузионного культивирования органов. После децеллюляризации легкие мышей стали белыми и полупрозрачными, что указывает на удаление клеточных компонентов при сохранении общей структуры легких. Гистологический анализ децеллюляризованных легких мышей показал неповрежденные альвеолярные структуры, в которых не осталось клеточных компонентов. У рецеллюляризированных мышей легкие в три раза по 10 в степени семи HUVEC после двух дней перфузионного культивирования в биореакторе наблюдалось однородное распределение HUVEC. HUVEC мигрировали в периферические альвеолярные области, образуя капилляроподобную сеть, как это наблюдается в рекуллюляризированных легких.