Порядок легких инженерных

Общей целью этой процедуры является получение легочной ткани в культуре, которая морфологически и физиологически сопоставима с нативной легочной тканью. Это достигается путем забора сердца и легких у взрослой крысы. Следующим шагом является канюлирование легочной артерии и трахеи и подключение канюлированных легких к биореактору для децеллюляризации.

После децеллюляризации и промывания легкое переносят в биореактор для стерильных культур и подготавливают к посадке. Заключительным этапом процедуры является засеивание нужного компартмента легкого подготовленной популяцией клеток. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что децеллюляризованный внеклеточный матрикс эффективно заселяется клетками, экспрессирующими регионарно-специфические маркеры легких, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами культивирования клеток легких in vitro заключается в том, что клетки сохраняют дифференцированные фенотипы в течение длительного периода времени, поэтому их можно изучать в течение нескольких недель в трехмерном биологически полученном субстрате. Для децеллюляризации легкие подключаются к колпачку биореактора через сосудистую канюлю, а колпачок подключается к аппарату децеллюляризации. Стеклянная бутылка над легкими удерживается на месте с помощью подставки для колец и прикрепленного зажима.

На этом этапе клеточный материал может быть удален для получения каркаса внеклеточного матрикса, который может быть повторно заселен клеточным материалом. Сборка биореактора для посева и культивирования инженерной легочной ткани показана на этой схеме. Соединитель замка приманки трахейной канюли соединяется с дыхательной петлей между резервуаром трахеи и основной камерой.

Дыхательный контур включает в себя два односторонних клапана. Положение таково, что среда следует по другому пути в легкое и из него. Небольшой резервуар временно включается в перфузионную линию для посева эндотелиальных клеток.

Пульсирующий насос используется для доставки клеток из резервуара в сосудистый отсек легкого. Сосудистая перфузия обеспечивается с помощью роликового насоса. Среда перфузируется в легочную артерию через прикрепленную канюлю, проходит через сосудистую сеть легких и выходит из легочной вены непосредственно в главный биореактор, где среда набирается для перфузии.

Легочный эпителий помещается путем инъекции в дыхательную петлю. Основная камера, содержащая легкое и резервуар трахеи, используются для долгосрочного культивирования легких. После извлечения легких и правильной канюлирования артерии и трахеи свежеизвлеченные легкие должны удерживать воздух без утечки.

В этом можно убедиться, надув их воздухом во время погружения в жидкость. Не должно быть никаких пузырьков, указывающих на утечки воздуха. Чтобы начать протокол, легкие надуваются с помощью PBS, содержащей нитропресс натрия, до тех пор, пока легкие не будут заполнены, но не передуты, немедленно закрывают трахейную канюлю, чтобы легкие оставались надутыми.

Затем перфузируйте легкие PBS и SNP в течение не менее 15 минут при 15 миллиметрах ртутного столба. После этого снимите пробку с трахейной канюли, чтобы позволить легким сдуться. При необходимости продолжайте перфузию с PBS и SNP в течение 15–30 минут.

Заправляйте PBS и SNP, чтобы обеспечить поддержание избыточного давления на уровне от 10 до 15 мм ртутного столба. Чтобы начать процедуру длительной децеллюляризации, колпачок биореактора соединяют с аппаратом децеллюляризации. Затем легкие соединяются с шапкой.

С помощью замковых соединений приманки, соединенных с канюлей в форме YS, канюля легочной артерии должна соединиться с перфузионной линией, а трахеальная канюля должна свободно плавать. Чтобы обеспечить полную децеллюляризацию ткани, крайне важно не допускать попадания воздуха в систему. Односторонние клапаны в артериальной и трахеальной канюле помогают очищать пузырьки воздуха в трубке, обеспечивая обратный поток в трубке.

Поэтому, позволяя удалить пузырьки воздуха с помощью шприца, убедитесь, что все трубопроводы очищены от воздуха. Начните перфузию с раствора для децеллюляризации. Перфузируется раствором для децеллюляризации.

До тех пор, пока 500 миллилитров раствора не пройдут через легкие, оптимальное давление составляет менее 15 миллиметров ртутного столба. Обычно на это уходит 2,5 часа. Скорость потока, как правило, сначала очень медленная и быстро увеличивается в течение второго часа примерно до одного миллилитра в минуту или более.

Во время перфузии периодически удаляется, используется децеллюляризирующая жидкость из биореактора, при этом обеспечивается достаточное количество жидкости для поддержки легкого и трахеальной канюли. Когда перфузия с жидкостью для децеллюляризации завершена, перенесите легкие и биореактор в колпак для культуры тканей. Чтобы начать полоскание органов, удалите 500-миллилитровую банку, содержащую жидкость для децеллюляризации, и замените ее стерильной банкой, содержащей до одного литра стерильного PBS.

Используйте вакуумную аспирацию или шприц, чтобы убедиться, что в магистралях нет воздуха, проведите PBS через сосудистую сеть с температурой от 10 до 15 миллиметров ртутного столба таким же образом. Что касается децеллюляризации, то с помощью стерильных методик периодически удаляют отходы PBS из биореактора и заменяют или наполняют банку PBS. При использовании свежего стерильного PBS продолжайте полоскание до тех пор, пока не будет перфузировано не менее 2,5 литров стерильного PBS в легких.

Обычно это занимает два дня с начала процесса децеллюляризации, когда полоскание завершено. Переведите легкие в новую стерильную биореакторную систему, содержащую свежий PBS плюс 10% FBS плюс 10% стрептококк Pen, чтобы убедиться, что вся перфузионная петля и все дыхательные пути заполнены жидкостью. С этого момента пульсирующий насос будет использоваться для перфузии легких со скоростью пять миллиметров в минуту.

Стерилизуйте каркас внеклеточного матрикса легкого путем ночной перфузии PBS, который содержит 10% FBS и 10% пенициллина стрептомицина. После выполнения этого шага перенесите легкие в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один час или до тех пор, пока температура не уравновесится. При подготовке к лечению с помощью Бен Насе, следующим шагом будет лечение легких с помощью Бен Насе.

Чтобы удалить остаточную ДНК для каждого легкого, сначала наполните один 10-миллилитровый шприц только буфером Prewarm Ben Nase, а один 10-миллилитровый шприц — 90 единицами на миллилитр. Бен Насе разводят в буфере Бен Насе. Прекратить перфузию легких.

Затем надуйте дыхательные пути с помощью буфера Ben Nase, избегая впрыскивания воздуха в легкое. Дайте легкому сдуться в течение одной минуты. Затем надуйте легкое раствором Бен Назе.

Опять же, будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в легкое после надувания с Беном Нейсом. Дайте легким посидеть без перфузии или вентиляции при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. По истечении одного часа возобновите перфузию с помощью PBS плюс 10% FBS 10% пенициллина стрептомицина, который уже находится в биореакторе, и продолжайте перфузию в течение ночи на следующий день.

После промывки и стерилизации длинный каркас внеклеточного матрикса может быть подготовлен для репопуляции клеток. Замените бензодиазепин P-B-S-F-B-S раствором на 250 миллилитров культуры. Проведите среду не менее чем за один час до введения клеток и замените свежей питательной средой непосредственно перед посевом клеток.

Многие клеточные источники могут быть использованы для удаления органов. Здесь будет продемонстрировано сидение с популяцией эпителиальных клеток. Сначала приготовьте шприц, содержащий 15 миллилитров клеточной суспензии нужной популяции эпителиальных клеток.

Затем заполните резервуар для дыхательных путей 80 миллилитрами питательной среды и убедитесь, что все вентиляционные линии очищены от воздуха. Затем поместите биореактор в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и подключите шприцевой насос для вентиляции. Засейте клетки в легкие с помощью одного быстрого болюса путем введения 15-миллилитровой клеточной суспензии в канюлю трахеи.

Убедитесь, что воздушные фильтры на главном биореакторе закрыты. Затем немедленно начните один медленный вдох с помощью шприцевого насоса для забора 60 миллилитров воздуха из главного биореактора со скоростью три миллилитра в минуту. Это будет длиться примерно 20 минут.

Позвольте легким находиться в статическом состоянии в течение примерно 18 часов после этого. Начните медленную перфузию сосудов примерно по 0,5 миллилитра в минуту. Во время культивирования органов перфузия обычно выполняется со скоростью от одного до трех миллилитров в минуту.

При использовании роликового насоса во время культивирования эпителия вентиляция обычно обеспечивается с непрерывной скоростью один вдох в минуту и дыхательным объемом от 5 до 10 миллилитров. С помощью шприцевого насоса воздух циклически всасывается и впрыскивается в биореактор для воздействия на дыхание путем чередования отрицательного давления и атмосферного давления внутри основной камеры. В связи с необходимостью поддержания герметичности биореактора во время вентиляции вентиляцию следует ежедневно приостанавливать и осуществлять обмен воздуха в основной камере.

Кроме того, среду следует менять примерно каждые три-четыре дня. Во время культивирования примерно половина общего объема должна быть заменена каждый раз путем культивирования легочного эпителия и эндотелия сосудов. В каркасе, установленном на биореакторе, мы можем генерировать легочную ткань, которая способна участвовать в газообмене в течение коротких промежутков времени.

Здесь показано стандартное окрашивание гемата, тоина и эоина нативного легкого крысы для сравнения с окрашиванием H и e децеллюляризованного легкого крысы. Окончательный децеллюляризованный внеклеточный матрикс должен быть полностью лишен клеточных материалов и сохранять грубые, микроскопические и ультраструктурные характеристики нативного легкого. Окрашивание h и e позволит визуализировать любой остаточный слой ДНК, прилипший к каркасу в результате недостаточной децеллюляризации или промывки оптимальных условий для посева клеток и последующего культивирования легкого.

Биореактор должен давать хорошо распределенные клетки во всех пяти долях легкого и обеспечивать покрытие примерно 70% каркаса внеклеточного матрикса. Эти изображения сравнивают нативное легкое с повторно заселенным легким при окрашивании иммунофлуоресценцией. Что касается ключевых маркеров легких, популяция культивируемых клеток положительна на секреторный белок клеток Клары просекреторный белок С и аквапорин 5.

Интересующие нас маркеры показаны красным цветом, а окрашенные ядра DAPI — синим на всех панелях. После освоения этой процедуры от децеллюляризации до отступления, может быть выполнена за четыре-пять дней, если она выполнена правильно.