Приматов легких Decellularization и Recellularization помощью специализированного большого органа биореактор

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать биологические матрицы целых органов из легких Реуса Маккаса и использовать эти матрицы в качестве каркасов для исследования приложений инженерии легочной ткани. Это достигается путем первичной децеллюляризации целых легких мамы Ройсса с помощью детергентов, солей и ферментов. Второй шаг заключается в установке децеллюляризованных легочных каркасов в биореактор, способный как вентилировать дыхательные пути, так и перфузировать легочную сосудистую сеть жидкими средами для культивирования клеток.

Затем легочные каркасы засаживаются стволовыми клетками через дыхательные пути и эндотелиальными клетками через легочную сосудистую систему. Заключительным этапом является культивирование клеток в каркасе легких в условиях вентиляции и перфузии, обеспечиваемых биореактором, в течение желаемого периода времени с последующим анализом полученной клеточной и тканевой морфологии. В конечном счете, реизация бесклеточных скаффолдов легких маки стволовыми клетками и эндотелиальными клетками приводит к созданию инженерной ткани, которая имитирует анатомические и гистологические особенности нативных тканей легких.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инженерии легочной ткани, например, можно ли использовать стволовые или прогениторные клетки для регенерации легочной ткани отдельно или в сочетании со зрелыми эпителиальными и эндотелиальными клетками легких. Применение этого метода распространяется на терапию заболеваний легких терминальной стадии, поскольку использование бесклеточных матриц легких стволовыми или прогениторными клетками пациента имеет потенциал для увеличения количества донорских легких, доступных для трансплантации легких. Кроме того, полученные легкие, сконструированные с использованием собственных стволовых клеток пациента, могут быть устойчивыми к иммунному отторжению.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы посмотрели ранее опубликованное видео Джо, снятое сотрудниками лаборатории доктора Лоры Николсон в Йельском университете. Здесь мы представляем модификации их процедуры для грызунов в соответствии с потребностями нашей модели крупного животного Resus Meac. При работе с тканями маки необходимо проявлять максимальную осторожность для предотвращения случаев инфицирования.

Перед тем, как работать с тканями приматов, наденьте средства индивидуальной защиты, включая хирургическую маску, лицевой щиток, один слой хирургических перчаток, одноразовый халат и второй слой хирургических перчаток с легкими, лежащими плашмя в лотке для препарирования, канюлируйте легочную артерию с помощью соединителя для приманки самки с заусенцем соответствующего размера. Закрепите канюлю на месте с помощью стерилизованной спиртом стяжки. Наденьте пластиковую стяжку на молнию вокруг трахеи.

Вставьте женский соединитель приманки в отверстие трахеи и затяните стяжку вокруг заусенца разъема, чтобы удерживать трахею на месте вокруг заусенца. Удалите захваченный воздух из легких, закапывая фосфатный буферный раствор или PBS, содержащий 30 единиц на миллилитр гепарина и пять микрограммов на миллилитр нитропресса натрия. Сокращенный SNP позволяет раствору выталкиваться за счет естественной отдачи перед повторением.

Повторная установка после третьей установки дыхательных путей с помощью раствора PBS Heparin SNP. Закройте канюлю для трахеи пробкой для приманки. Отрежьте верхушку сердца и орошите внутренние желудочки с помощью PBS Heparin SNP для удаления остаточной крови, разорите оба предсердия, чтобы облегчить дренаж легочной артерии после перфузии.

Прикрепите шприц объемом 60 куб. см, наполненный раствором гепарина PBS SNP, к канюле легочной артерии и осторожно извлеките поршень, чтобы жидкость попала в сосудистую систему. Снимите пробку с трахейной канюли и дайте жидкости из дыхательных путей выйти за счет естественной отдачи. Продолжайте перфузию до тех пор, пока из легочной сосудистой сети не будет удалено как можно больше крови.

Самым сложным аспектом процедуры является эффективное промывание и промывание дыхательных путей легких С жидкостями поток жидкости замедляется по сравнению с газами, поскольку дыхательные пути не предназначены для проведения жидкостей, время и пациенты необходимы для выполнения этих шагов, мы рекомендуем продолжать следовать протоколу, несмотря на то, что остаточная жидкость остается в дыхательных путях по мере прогрессирования децеллюляризации и вымывания клеточного мусора, вязкость жидкости останется низкой, и легкие смогут эффективно выводить жидкости в первый день. Погрузите блок сердечных легких в деионизированную воду, надуйте и перфузируйте легкое деионизированной водой с помощью шприцев объемом 60 куб. см, прикрепленных к погруженной трахеальной и артериальной канюле соответственно. Эффективно повторите промывание дыхательных путей и сосудов деионизированной водой.

Еще четыре раза, в общей сложности пять полосканий примерно от 0,5 до одного литра каждое, после пяти промываний извлеките легкие из воды и погрузите блок в раствор Тритона. Надуйте и перфузируйте легкие раствором Тритона. Как и раньше, повторите установку во второй раз и инкубируйте погруженные органы в растворе Тритона в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

После ночной инкубации извлеките легочную блокаду из раствора Triton и промойте снаружи деионизированной водой. Затем погрузили блок в пресную деионизированную воду. Закапывайте деионизированную воду в трахею и легочную артерию пять раз, чтобы вымыть раствор Тритона и клеточный мусор.

Извлеките легкие из деионизированной воды и погрузите в 2%-ный раствор дезоксиоксида натрия или SDC. Таким же образом надувайте и перфузируйте раствором SDC. Погрузите легкие в раствор SDC на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на третий день.

Еще раз промойте ткань деионизированной водой наружно и через дыхательные пути и сосуды пять раз. Как и раньше, извлеките ткань из деионизированной воды и погрузите в один молярный раствор хлорида натрия. Надуть и перфузировать раствором хлорида натрия, как и раньше, и погрузить ткань в раствор хлорида натрия на один час при комнатной температуре, предварительно промыв легкие от раствора хлорида натрия пятью полосканиями деионизированной водой.

Как и раньше, купайте их в свежем растворе ДНК и закапывайте этот раствор в дыхательные пути и сосуды. Инкубируйте легкие в растворе ДНК в течение одного часа при комнатной температуре. Затем извлеките легкие из раствора ДНК и промойте наружно раствором PBS.

Погрузите легкие в раствор PBS и промывайте этот раствор пять раз через дыхательные пути и сосуды. Как и раньше, храните легкие в растворе PBS в герметичном контейнере на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на четвертый день. Промойте легкие свежим ледяным раствором PBS пять раз через дыхательные пути и сосуды.

Затем храните их в растворе PBS в стерильном герметичном контейнере при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Соберите компоненты биореактора под ламинарным проточным колпаком в соответствии со схемой. В текстовом протоколе заполните основную камеру питательной средой, которая была уравновешена до 5%-ной атмосферы CO2 инкубатора для клеточных культур непосредственно перед использованием в биореакторе, приложите адаптеры трахеи и сосудистой канюли к канюле легких.

Установите органы в основную камеру биореактора, омыв легкие в питательной среде и прикрепив адаптеры канюли к соответствующим портам модифицированной крышки. После подключения надежно и плотно зафиксируйте крышку. Камера не будет вновь открываться в течение всего времени реации аспирации воздуха из трубки с помощью отверстий шприца и шприца 60 CCC, оснащенного иглой 18 калибра, перемещающей направление трехходовых стопорных кранов для направления потока жидкости в шприц

Переместите герметичные смежные соединенные камеры биореактора с установленными органами в инкубатор для культуры тканей для балансировки температуры и газа. Проветрите легкие с помощью шприцевого насоса, прикрепленного к основной камере, примерно один полный вдох каждые две минуты, и перфузируйте сосудистую сеть с помощью перистальтического насоса со скоростью примерно 10 миллилитров в минуту в общей сложности 30 минут для сидения в дыхательных путях. Надувайте легкие с помощью клеточной суспензии, осторожно вводя через порт шприца, прикрепленный к трехстороннему стопорному крану в дыхательной петле.

Удерживайте легкие статически при температуре 37 градусов Цельсия, 5% CO2 в течение ночи без перфузии дыхательных путей или сосудов, чтобы позволить клеткам прикрепиться к децеллюляризованному матриксу легких. После ночной инкубации возобновите стандартную программу вентиляции дыхательных путей и бактериологическое исследование, органы на три-семь дней для сидения сосудов. Направленность пути потока может быть изменена от основной камеры к эндотелиальному седельному резервуару путем вращения клапана на запорном кране, расположенном в трубке, соединяющей эти два отсека, постепенно с помощью перистальтического насоса и при осторожном перемешивании с помощью магнитного перемешивания после завершения посева.

Взбейте перфузию и статически инкубируйте в течение примерно четырех-шести часов. Возобновить перфузию сосудов средой основной камеры со скоростью примерно 10 миллилитров в минуту. Посев в течение трех-семи дней с непрерывной перфузией сосудов одновременно с периодом культивирования вентиляционных отверстий.

На протяжении всего процесса децеллюляризации легкие MCCA демонстрировали прогрессирующее отбеливание, достигающее кульминации в полупрозрачном виде в конце процесса. Тем не менее, легкие сохранили свои грубые анатомические особенности и оставались в значительной степени эластичными и способными производить естественную отдачу после надувания жидкостью. На микроскопическом уровне.

Гистологическая ультраструктура осталась нетронутой после децеллюляризации. То есть бронхиальные, дыхательные, бронхиальные, альвеолярные мешочки. Кровеносные сосуды и капилляры все еще были достаточно четко различимы при микроскопии с низкой мощностью.

Гистологическая микроанатомия, однако, показала, что в то время как общая анатомия и ультраструктура легкого были слегка нарушены децеллюляризацией, в ткани полностью отсутствовали интактные клетки, как показано здесь. В децеллюляризованных тканях остались лишь следовые количества ДНК. Кроме того, следовая ДНК, которая была сконцентрирована осаждением спирта и визуализирована в геле 0,8% AROS, состояла в основном из низкомолекулярных фрагментов.

Эффективность удаления клеточного белка оценивали с помощью вестерн-блоттинга как нативного, так и децеллюляризованного белка легких. Лизаты с использованием антитела к бета-актину, бета-актину были легко обнаружены в нативных лизатах легких, но не в децеллюляризованных лизатах легких, что позволяет предположить, что децеллюляризация резко истощает клетки и удаляет связанный с клетками белковый материал через 14 дней после посева через дыхательные пути мезенхимальными стволовыми клетками или BMC, полученными из костного мозга маки, и культурой биореактора с примерно одним циклом выдоха каждые две минуты. Паренхима децеллюляризованных легких маки была эффективно изирована.

BMC выстилают альвеолярные септы, сохраняя при этом чистый и открытый альвеолярный просвет. Оголенный матрикс крупных дыхательных путей также был выделен BMC с использованием биореактора, люминальная поверхность главного стволового бронха была выстлана монослоем плоскоклеточных BMC после 14 дней культивирования. В показанном здесь биореакторе находится децеллюляризованная реусовая доля легкого через пять дней после засеивания сосудистой сети микрососудистыми эндотелиальными клетками и обеспечения постоянной перфузии сосудов эндотелиальной питательной средой со скоростью пять миллилитров в минуту.

Гистологический анализ выявил клетки, выстилающие малую сосудистую сеть в паренхиме легких. В некоторых случаях клетки, по-видимому, были прикреплены к матриксу через несколько клеточных проекций через просвет, в то время как другие поперечные срезы сосудов показали клетки, выстилающие поверхность эндотелия прозрачным просветом. Следуя этой процедуре.

Другие методы, такие как иммуногистохимия, вестерн-блоттинг и количественная ПЦР в реальном времени, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, дифференцируются ли засеянные стволовые клетки в клетки легочной линии после культивирования на бесклеточном матриксе легких или со зрелыми эпителиальными и эндотелиальными клетками в биореакторе. После просмотра этого видео у нас должно сложиться хорошее понимание того, как децеллюляризировать легкие приматов и впоследствии использовать полученные бесклеточные легкие в качестве каркасов для культивирования стволовых клеток, эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток в биореакторной системе. Не забывайте, что работа с тканями приматов может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение полного индивидуального защитного снаряжения, включая лицевой щиток и двойной слой латексных или нитриловых перчаток.