3D-генерация ткани миокарда человека с использованием электроспиннинговой записи поликапролактонных скаффолдов и сердечных клеток, полученных из ИПСК

Представлен воспроизводимый метод получения 3D тканей миокарда, сочетающий скаффолды поликапролактона (PCL) и фибриновые гидрогели с кардиомиоцитами и фибробластами, полученными из hiPSC. Этот метод обеспечивает точный контроль над архитектурой каркаса и может быть применен в доклинических испытаниях лекарств и моделировании сердечных заболеваний.

Это исследование направлено на разработку биометрических 3D-тканей сердца с использованием расплавленных электрических каркасов и сердечных клеток, полученных из iPSC, для улучшения моделирования заболеваний, тестирования лекарств и приложений регенеративной медицины. Индуцированный человеком отчет в кардиомиоцитах стволовых клеток остается незрелым, что ограничивает их функциональность. Кроме того, сложно воспроизвести сложность, необходимую для моделирования сердечной ткани в 3D.

Эта модель лучше имитирует нативный миокард, обеспечивая сложные 3D-взаимодействия внеклеточного матрикса для моделирования заболеваний, тестирования лекарств и применения для конкретных пациентов. Он предлагает более актуальную альтернативу 2D-культурам и моделям животных. В дальнейшем наши исследования будут сосредоточены на изучении кардиомиологических моделей, совершенствовании 3D-протоколов созревания тканей и разработке более крупных конструкций для доклинической терапии инфаркта миокарда на крупных животных моделях, таких как свиньи.

Для начала подсоедините шприц к напорной трубе подачи азота и введите его внутрь нагревательной камеры. Включите электропрядильное оборудование для расплава и установите регуляторы температуры на 80 градусов Цельсия для камеры и 65 градусов Цельсия для сопла. Через 30 минут переместите коллекторную пластину до тех пор, пока печатающая головка не окажется на одном краю пластины или в любом желаемом месте.

Отрегулируйте расстояние между камерой нагрева и коллекторной пластиной вручную с точностью до 10 миллиметров в плоскости z. Закройте дверцу оборудования, к которому автоматически подключается электроподача. Установите напряжение на семь киловольт при давлении азота на два бара для экструзии через наконечник 23 калибра.

Загрузите код дизайна G в программное обеспечение для печати скаффолдов с квадратной геометрией. Отрегулируйте скорость коллектора до 1080 миллиметров в минуту. Затем нажмите кнопку «Запустить цикл», чтобы начать печать.

После того, как печать будет закончена, осторожно снимите подмостки с коллектора. Разрежьте напечатанную сетку с помощью пуансона диаметром шесть миллиметров, чтобы получить окончательные каркасы для изготовления ткани. Обработайте каркасы в течение пяти минут кислородной плазмой.

Простерилизуйте сетки, погрузив их в 70% этанол на 30 минут. Тщательно промойте стерильной дистиллированной водой в течение 30 минут, затем дайте им высохнуть. После отделения кардиомиоцитов iPSC человека повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде для генерации тканей и подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра.

Аналогичным образом, после отделения сердечных фибробластов iPSC человека, повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде для генерации тканей и подсчитайте клетки. Смешайте необходимое общее количество клеток в новой пробирке и назовите содержимое Cell Mix. И центрифугировать при 300G в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем повторно суспендируют клеточную смесь в необходимом объеме тканевой генерирующей среды. Чтобы получить Hydrogel Mix, добавьте необходимое количество фибриногена в тюбик комнатной температуры и тщательно перемешайте. Нанесите гидрогелевую смесь на поверхность политетрафторэтилена, чтобы предотвратить адгезию фибрина к пластине.

Пипеткой нанесите половину объема ткани, оставив ее в виде капли. Поместите поликапролактон или PCL каркас поверх каждой капли и добавьте оставшийся объем на каркас. Теперь добавьте необходимое количество тромбина и быстро перемешайте гидрогель, тщательно избегая образования пузырьков.

Инкубируйте ткани при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы завершить полимеризацию фибрина. Аккуратно возьмите каждую салфетку за край с помощью стерильного пинцета и перенесите их на 12 луночных планшетов, содержащих среду для генерации тканей с добавлением апротинина. Инкубируйте ткани при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день обновите среду двумя миллилитрами среды для поддержания тканей, удалив остатки KSR и Y-27. Посев смеси кардиомиоцитов iPSC человека и сердечных фибробластов iPSC человека в фибриновые гидрогели приводит к равномерному распределению клеток по порам каркаса в течение одного часа после полимеризации. Конфокальные иммунофлуоресцентные изображения показали смешанное распределение клеток через 3D-ткань, взаимодействующую с каркасом PCL с большинством кардиомиоцитов iPSC человека, окрашенных на саркомерный актинин, перемежающихся с мечеными виментином сердечными фибробластами iPSC человека.

Кардиомиоциты iPSC человека демонстрируют хорошо организованную саркомерную структуру за счет равномерно расположенного белка саркомерного актинина. Клетки начали спонтанное биение на второй день со средней частотой биения 30 ударов в минуту на седьмой день, демонстрируя стабильное сокращение по всей сетке. Со временем наблюдалось постепенное снижение, достигнув 17 ударов в минуту к 14-му дню.

Несмотря на это, метаболическая активность оставалась стабильной в период с 7 по 14 день, что подтверждает устойчивую жизнеспособность клеток. Наконец, анализ точек слежения бьющихся тканей показал скорость сокращения 38 микрометров в секунду и амплитуду сокращения 29 микрометров.