Генерация неприсоединения функциональной ткани миокарда Через микроконтактной печати

Целью данного эксперимента является получение выровненной функциональной ткани миокарда с помощью микроконтактной печати. Это достигается путем первой микроконтактной печати фибронектина на подложках из полидиметилсилоксана. В качестве второго шага – двойной трансгенный.

Линии эмбриональных стволовых клеток дифференцируются in vitro и выделяются с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток, что позволяет получать высокоочищенные популяции сильно кардиогенных предшественников. Затем изолированные сердечные предшественники засеиваются на микропатентованные субстраты PDMS, чтобы сделать их злокачественными и принять форму палочки, похожую на сердечные миоциты. Получены результаты, свидетельствующие об успешном выделении и изотропном росте сердечных предшественников на основе фактов и иммунофлуоресцентного анализа.

Создание изотропной ткани миокарда может способствовать прогрессу в области биологии стволовых клеток и тканевой биоинженерии, повышая возможность разработки специфических для болезни клеток для разработки и открытия лекарств. И заложив основу кардиологической регенеративной медицины. Первый защитный кожух IL, 180 4 полидиметилалана-эластомер в соотношении 10 к одному на основе корректирующего агента и хорошо перемешать.

Дегазируйте сборку с помощью влагопоглотителя для удаления пузырьков воздуха. Залейте PDMS в предварительно изготовленный шаблон шириной 20 микрон и двумя микронными выступами инструмента, разделенными расстоянием 20 микрон, затем отверждайте в течение двух дней в влагопоглотителе при комнатной температуре, чтобы получить штампы PDMS с микротекстурой. После нанесения PDMS штамп поверхности гидрофилизируют с помощью плазменного очистителя.

Стерилизуйте штампы с 70%-ным этанолом в течение одной минуты. В шкафу биологической безопасности быстро высушите его сжатым воздухом. Покройте стерильные поверхности штампов раствором фибронектина для впитывания в течение не менее 10 минут после впитывания.

Стряхните с штампов раствор фибронектина и быстро просушите сжатым воздухом. Установите конформный контакт между штампом и заранее подготовленными стеклозащитными листами с покрытием PDMS, как описано в текстовом протоколе, в течение двух минут и плотно прижмите. Промойте микроузорчатые подложки дистиллированной водой.

Храните их в дистиллированной воде не более четырех недель при температуре четыре градуса Цельсия, если они не предназначены для немедленного использования. Смажьте шесть лунок планшетов стерильным 0,1%-ным желатином в дистиллированную воду и дайте ему впитаться в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия В течение этого времени подготовьте эмбриональные фибробласты мыши из ахор аликвоты, добавив их в 50 миллилитров PBS в коническую пробирку. Центрифугируйте метамфетамин при 1000 об/мин в течение пяти минут и снова суспендируйте их в метамфетаминовой среде.

По истечении времени инкубации аспирируйте избыток желатина и добавьте мес в лунки. Дайте МОН один день на присоединение. Подготовьте эмбриональные стволовые клетки или ЭС-клетки из мысленной аликвоты, добавив их в 50 миллилитров PBS в конической пробирке центрифуги.

ES элементы 1000 об/мин в течение пяти минут и Resus суспендируют их в среде ESC. Добавьте клетки E ES в лунки, содержащие мифы, и поддерживайте в среде ESC до тех пор, пока не будет достигнуто слияние для массажа сливающихся ES-клеток. Сначала аспирируйте среду ESC и один раз промойте клетки стерильным PBS.

Затем аспирируйте PBS и добавьте 500 микролитров трипса в, ну. Выдерживайте тарелку в течение трех с половиной минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Проведите пипеткой раствор TRIPSIN вверх и вниз несколько раз.

Во-первых, они разрушают колонии Е-эс-клеток. Затем нейтрализуют раствор трипсина, добавив в лунку 500 микролитров среды ЭСК. Массируйте ЭС клетки в соответствии с необходимым соотношением, здесь Е ЭС клетки проходят в соотношении один к 30, что позволяет им достичь слияния в течение трех дней.

Дифференцировку in vitro начинают, когда ЭС-клетки достигают слияния. Первым слоем 10-сантиметровую культуру посуды обваляем стерильным 0,1%-ным желатином в дистиллированной воде и даем ему впитаться в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В течение этого времени соберите ES-клетки, как и раньше.

По истечении 15 минут аспирируйте избыток желатина и добавьте примерно от одной трети до половины суспензии клеток E ES в культивируемые чашки, содержащие адаптационную среду. После культивирования клеток в адаптационной среде в течение двух дней соберите адаптированные ES-клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую PBS, используя 1,5 миллилитра трипсина. Центрифугируйте их при 1000 об/мин в течение пяти минут и снова суспендируйте в дифференцировочной среде.

Изготовьте тела эмбрионов или EBS из примерно 1000 клеток на 10 микролитров дифференцировочной среды в 15-сантиметровых чашках для культивирования. С помощью многоканальной пипетки переверните планшеты и культуру. EBS подвешивает капли в течение двух с половиной дней при температуре 37 градусов по Цельсию.

Через два с половиной дня вытяните EBS из шести до восьми 15-сантиметровых чаш в одну, используя дифференцировочную среду, и культивируйте их в течение следующих трех с половиной дней. Еще через три с половиной дня соберите EBS в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и промойте планшет стерильным PBS, чтобы собрать все EBS. Затем дайте им опуститься на дно примерно на пять минут.

Затем снимите супинат и промойте EBS стерильным PBS. Дайте EBS снова опуститься на дно примерно на пять минут. Диссоциируйте ЭБС, добавив 2,5 миллилитра трипсина, и мягко встряхните трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут.

Затем добавьте 2,5 миллилитра стерильного PBS в раствор трипсина и пипетку вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров примерно восемь-10 раз, чтобы разрушить клеточные кластеры. Нейтрализуйте трипсин с помощью 10 миллилитров факсимильного буфера, содержащего 7,5% E ES клетки или FBS дифференцировочной дифференцировки и 0,01% DPI в центрифуге PBS, диссоциировав EBS при 1000 об/мин в течение пяти минут. Затем удалите супинат и добавьте примерно один миллилитр буферной пипетки факса вверх и вниз с помощью пипетки объемом в один миллилитр примерно от восьми до 10 раз, чтобы разрушить кластеры клеток.

Перенесите клетки в стерильную трубку с круглым дном с сетчатым фильтром 35 микрон, чтобы получить одноклеточную суспензию. Сортировать дифференцированные ЭС-клетки с помощью проточного цитометра aria и получать очищенные популяции коммитированных предшественников желудочков. Подробную стратегию стробирования см. в текстовой части протокола.

Съел микроподложки с 1%onic F1 27 в дистиллированной воде в течение 10 минут. Затем вымойте их три раза стерильным PBS. Прикрепите прокладки PDMS вокруг области рисунка и плотно прижмите.

Затем затравливают сердечные предшественники на субстраты микросхемы фибронектина. Следующие изображения взяты из репрезентативной диаграммы проточной цитометрии на шестой день in vitro дифференцированных ЭС-клеток. На этом рисунке показано стробирование по амплитуде прямого рассеяния FSCA и амплитуде бокового рассеяния SSCA.

Это позволяет отделять целые клетки от клеточного мусора. Здесь видно стробирование на FSCA и ширину прямого рассеяния FSCW. Это позволяет изолировать клеточные синглеты от дублетов и других клеточных агрегатов.

На этом рисунке показано стробирование на SSCA и рассеяние с SSCW. Это повышает чистоту клеточных синглетов. На этом изображении показано стробирование окрашивания FSCA и DPI, которое позволяет отделить жизнеспособные DPI-отрицательные клетки от нежизнеспособных.

Здесь наблюдается стробирование для fico, rine, PE и PE cyan в DI seven PE SI seven. Это позволяет получить истинные красные положительные и истинные эритроотрицательные клетки и исключить автофлуоресцентные эритроотрицательные клетки. На этих изображениях показано стробирование для подгонки амплитуды флуоресцеина изотиоцианата CA и PEA, которое позволяет сортировать истинно зеленые положительные и истинно зеленые отрицательные клетки в красных и красных отрицательных популяциях.

Факс-очистка дифференцированных ЭС-клеток in vitro позволяет выявить четыре различные популяции предшественников, как видно из этого графика проточной цитометрии. Четыре различные популяции прародителей: красный, положительный зеленый, положительный красный, положительный зеленый, отрицательный красный, отрицательный зеленый положительный и красный отрицательный зеленый. На этом репрезентативном изображении иммунофлуоресцентной микроскопии показаны микроструктурированные субстраты фибронектина.

Масштабная линейка представляет собой 80 микрон. На этом изображении показана репрезентативная иммунофлуоресцентная микроскопия эмбриональных фактов, изолированных предшественников на верхних панелях и фактов, полученных от ESL, изолированных предшественников на нижних панелях после дополнительного пятидневного культивирования ядер микропаттернов фибронектина, окрашенных в синий цвет. S-M-M-H-C-A окрашенный в красный цвет саркомерный альфа-актинин выглядит зеленым.

Масштабная линейка составляет 40 мкм. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить анизотропную функциональную ткань миокарда из возобновляемого клеточного источника сердечного протуса.