Чистый метод, основанный на плесень, создания эшафот бесплатный трехмерный сердечной ткани

Этот протокол описывает новый и простой метод создания трехмерной сердечной ткани на основе плесени, в котором сфероиды используются в качестве инструмента для создания свободной сердечной ткани из каркаса. В наших экспериментах были выделены три типа клеток: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, кардиомиоциты человека, сердечные фибробласты человека и эндотелиальные клетки пупочной вены человека, которые были использованы для получения клеточной суспензии. Содержит 70% кардиомиоцитов, 15% фибробластов и 15% эндотелиальных клеток в конической пробирке объемом 50 мл.

Затем мы дозируем клеточную суспензию в каждую лунку подвесной капельной системы со сверхнизким прикреплением, что приведет к спонтанному образованию сотен бьющихся сфероидов через три дня. Затем сфероиды собирают и помещают в новую полость плесени. Затем ткань выдерживают в стерильном контейнере со средой, на шейкере в инкубаторе в течение нескольких дней.

Впоследствии плесень удаляется, в результате чего образуется свободный от каркаса тканевый участок с механической целостностью. Подвесное каплевидное устройство представляет собой многоразовую лунку со сверхнизким уровнем крепления и 850 микропорами, каждая диаметром 350 микрон. Подвесная капля совместима со стандартными шестилуночными планшетами.

После изготовления клеточной суспензии мы дозируем четыре миллилитра клеточной суспензии, содержащей 10 миллионов клеток, в каждую лунку подвесной капельной системы. Устройства культивируются при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и влажности 95%. Через 72 часа наблюдается спонтанное образование бьющихся сфероидов, со средним диаметром 350 мкм.

Сфероиды собирают, помещая подвесное устройство в другую чашку со средним уровнем и осторожно вращая, чтобы освободить сфероиды и позволить им дрейфовать через поры на дне подвесной капельной системы. Это схема новой формы для трехмерного создания сердечной ткани без каркаса. Он включает в себя коврик для обработки, наполнительную базу и новую форму.

Новая форма состоит из основания, нижней квадратной пластины, нижней сетки, 10 слоев боковых сеток, изготовленных из тонких зубцов из нержавеющей стали. Верхняя сетка, верхняя квадратная пластина, удерживающие трубки и стопорные штифты. Система Novel Mold может создавать ткани разных размеров, в том числе два на два миллиметра, четыре на четыре миллиметра и шесть на шесть миллиметров.

Нижняя квадратная пластина и нижняя сетка складываются друг на друга и выравниваются с помощью угловых стоек. 10 слоев боковых сеток затем укладываются в чередующихся направлениях, чтобы создать сетку из тонких зубцов из нержавеющей стали с помощью пары стерильных щипцов. Затем заполняющее основание промывают фосфатным буферным раствором 1X или PBS для снижения поверхностного натяжения перед установкой сфероидов в новую форму.

После смачивания новой полости плесени в том же метане, сфероиды рассаживаются в предполагаемую полость нужного размера. После посадки избыток среды стекает через сетчатую форму, позволяя сфероидам заполниться и принять форму заданной полости. Затем верхняя сетка и верхняя квадратная пластина устанавливаются на угловые стойки, а стопорные штифты и удерживающие трубки фиксируются для предотвращения вымывания сфероидов.

Заполненная новая система пресс-формы переносится на шестилуночную пластину с шестью миллиметрами добавки среды B-27, а затем выдерживается в инкубаторе на качающемся вибростенде в течение семи-десяти дней при 30-40 оборотах в минуту. Продолжительность инкубации может быть изменена в зависимости от размера сердечного пятна. После инкубации система извлекается и удаляется удерживающая трубка, пробки, верхняя квадратная пластина и верхняя сетка.

Затем слоистые боковые сетки осторожно выдвигаются одна за другой, стараясь не повредить ткань. После удаления всех боковых сеток поверх нижней сетки получается неповрежденная сердечная заплатка. Функциональное синхронное избиение наблюдается в течение 24 часов.

Этот новый метод, основанный на пресс-форме, является эффективным и простым методом создания трехмерных каркасных тканей сердца с минимальными ручными усилиями. Полученные многослойные ткани состоят из сросшихся сфероидов с удовлетворительной структурной целостностью и синхронным биением. Этот новый метод, основанный на пресс-формах, представляет собой экономически эффективную и масштабируемую альтернативу существующим методам биопроизводства сконструированных тканей.