Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

В этой рукописи описывается создание определенных инженерных тканей сердца с использованием экспрессии поверхностных маркеров и сортировки клеток. Затем определенные ткани могут быть использованы в многотканевом биореакторе для исследования механизмов терапии сердечными клетками с целью создания функциональной, но контролируемой модельной системы человеческого сердца.

Общая цель этой процедуры заключается в создании инженерных человеком сердечных тканей с определенным клеточным составом. Этот метод может решить ключевые проблемы в области инженерии сердечной ткани, включая контроль вариабельности и эффективности сердечной дифференцировки, а также понимание того, как определенные типы клеток влияют на сократительную функцию сердца. Основное преимущество этой методики заключается в том, что конечным результатом является искусственная человеком сердечная ткань контролируемого и определенного состава.

Репликации этого метода распространяются на терапию сердечных заболеваний, потому что определенные ткани могут обеспечить новую, биологически значимую и биомедицинскую платформу для скрининга, способную оценивать терапевтические вмешательства. Хотя этот метод может дать представление о новых видах кардиотерапии, система сердечной ткани, созданная человеком, также может быть использована для понимания механизмов терапии сердечными клетками. Начиная с культур кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, промойте клетки один раз PBS и добавьте один миллилитр 0,04% трипсина-ЭДТА.

Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Когда клетки инкубируются, добавьте 12 микролитров ингибитора ROCK к шести миллилитрам раствора для нейтрализации трипсина. Выньте пластины из инкубатора и добавьте по одному миллилитру нейтрализующего раствора в каждую лунку шестилуночной пластины.

Перенесите все ячейки из каждой лунки в одну 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Промойте все шесть лунок одним трехмиллилитровым объемом PBS и соедините эту промывку с ячейками в пробирке. Центрифугируйте пробирку при 300 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать клетки.

Чтобы подготовить клетки к сортировке живых клеток с помощью FACS, приготовьте буфер для окрашивания, добавив пять миллилитров FBS и 50 микролитров ингибитора ROCK к 45 миллилитрам PBS на льду. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных клеток и повторно суспендируйте их в 1,2 миллилитрах окрашивающего буфера. Перенесите 200 микролитров взвешенных элементов в новую предварительно охлажденную 50-миллилитровую центрифужную пробирку на льду.

Затем переложите оставшийся один миллилитр клеточной суспензии в новую предварительно охлажденную 50-миллилитровую центрифужную пробирку на льду и добавьте два микролитра SIRP alpha-PE/Cy7 и четыре микролитра антител CD90-FITC. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию с помощью переводной пипетки и поместите пробирку на лед. Инкубируйте две 50-миллилитровые пробирки, содержащие отрицательный контроль и образец, на коромысле на льду при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

Пока клетки инкубируются, перенесите по три миллилитра дифференцировочной среды по два в каждую из двух 15-миллилитровых центрифужных пробирок. Затем добавьте три микролитра ингибитора ROCK и храните эти пробирки для сбора FACS на льду перед использованием. Затем гранулируйте окрашенные клетки при температуре 300 умножить на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

И вымойте их дважды с 10 миллилитрами ледяного PBS. Аккуратно суспендируйте гранулу образца одним-тремя миллилитрами красящего буфера, содержащего DAPI. Добавьте 500 микролитров буфера для окрашивания без DAPI в отрицательную контрольную гранулу.

Отфильтруйте обе клеточные суспензии через 40-микронный клеточный фильтр, чтобы удалить клеточные комки, а затем перенесите их в полистирольные трубки FACS на льду. Немедленно принесите образцы в сортировщик клеток. Начиная с отрицательного окрашивания контрольного образца, установите параметры стробирования.

Затем, запуская образцы клеток, выберите для DAPI отрицательную популяцию живых клеток. Соберите как FITC-положительные, так и PE/Cy7-положительные популяции клеток независимо друг от друга при 20 PSI. После культивирования и реагрегации клеток, как указано в текстовом протоколе, извлеките из инкубатора планшеты для культивирования клеток и переложите среду в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Вымойте пластины тремя миллилитрами PBS и переложите промывку в ту же 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем добавьте в тарелки три миллилитра 0,04% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Через пять минут осмотрите пластины на предмет отслойки клеток с помощью микроскопа.

Как только все клетки отсоединятся, добавьте в пластины три миллилитра раствора нейтрализующего трипсина. Аккуратно перемешайте и переложите ячейки в исходную 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Вымойте тарелки пятью миллилитрами PBS и добавьте эту жидкость в тюбик.

Гранулируйте клетки центрифугированием при 300-кратном перегрузке в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре неонатальной бычьей сыворотки, или среды NBS. Далее переложите ячейки в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку.

Гранулируйте клетки в 300 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость. Чтобы начать генерацию шести сконструированных сердечных тканей, разбавьте 60,0 микролитров из пяти миллиграммов на миллилитр коллагенового запаса до 3,125 миллиграммов на миллилитр с 1,5 микролитрами одного молярного гидроксида натрия, 9,6 микролитрами 10X PBS и 24,9 микролитрами стерильной ультрачистой воды. При этом крайне важно избегать попадания пузырьков воздуха в коллагеновую смесь, так как пузырьки воздуха медленно высвобождаются из вязкого раствора и могут препятствовать формированию тканей во время уплотнения тканей.

Пипеткой вниз по стене 15-миллилитровой пробирки добавьте по 12,0 микролитров каждого из 10X MEM и 0,2 нормальных куч при pH 9, чтобы разбавить коллагеновую смесь. Затем добавьте матрицу базальной мембраны в коллагеновую смесь до конечной концентрации 0,9 миллиграмм на миллилитр и аккуратно перемешайте. Храните эту окончательную тканевую смесь на льду.

Далее перенесите всю тканевую смесь в клеточную гранулу и добавьте дополнительные клетки, как указано в текстовом протоколе. Заполните пробирку до конечного объема 150 микролитров бесклеточной средой NBS и аккуратно перемешайте. Осторожно нанесите пипеткой 25 микролитров клеточной суспензии в каждую из шести лунок в опорной плите биореактора.

Повторите процедуру перемешивания между каждой лункой, чтобы повторно суспендировать любые клетки, которые могли осеть. Пипетка должна подаваться только по одной ткани в лунку за раз, чтобы обеспечить постоянный объем и количество клеток на ткань. По отдельности надавите на два ряда полидиметилсилоксана, или PDMS, датчики силы по обе стороны полисульфоновой рамы, чтобы сформировать шесть пар противоположных стоек.

Переверните раму сверху опорной плиты так, чтобы одна пара столбов входила в каждую лунку, содержащую клеточную суспензию. Затем поместите биореактор в 60-миллиметровую тарелку и поместите ее без крышки внутрь 10-сантиметровой тарелки. Закройте 10-сантиметровую чашку крышкой и переместите весь биореактор в инкубатор для культур тканей.

После двух часов инкубации снимите сборку биореактора и добавьте 14 миллилитров среды NBS, чтобы покрыть опорную пластину. Верните биореактор в инкубатор для клеточных культур и ежедневно меняйте половину среды. Через 48 часов аккуратно снимите опорную плиту на несколько миллиметров за раз.

Затем верните биореактор тканью вниз в среду. Если ткань отваливается от штифта при снятии опорной плиты, аккуратно прикрепите ткань к штифту. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека приводит к получению смешанной культуры, состоящей в основном из кардиомиоцитов и фибробластов, которые самоорганизуются в кластеры и образуют прочно бьющиеся паутины по всему блюду.

Сортировка этих культур методом FACS показала, что этот метод дифференцировки приводит к получению популяции, содержащей не менее 65% альфа-положительных клеток SIRP и 10% CD90-положительных клеток. После удаления опорной пластины искусственные человеком сердечные ткани, или ГЭКТ, могут самособраться внутри биореактора. Зрелые и уплотненные HECT заметно отклоняют встроенные стойки измерения силы в среднем с силой от 5 до 15 микроньютонов.

Измерения силы подергивания показывают, как изолированные переменные изменяют сократительную силу в этих определенных сконструированных тканях. При этом, когда ткани дополняются 10% мезенхимальными стволовыми клетками человека, наблюдается существенное усиление сократительной силы как на одногерцовой, так и на двухгерцовой частотах. После освоения дифференцировка займет примерно 20 дней, сортировка клеток — около пяти часов, а построение тканей — около трех часов.

Еще семь дней потребуется для правильного формирования тканей после строительства. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, включая мечение клеток и добавление тканевой смеси, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся эффектов конкретных межклеточных взаимодействий, или определить механизмы клеточной терапии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать искусственные человеком сердечные ткани с известным и контролируемым клеточным составом.