Многомасштабные исследования кортикального процессинга путем интеграции ламинарных политродов и оптогенетики с микроэлектрокортикографией у грызунов

В данной работе мы представляем два протокола для регистрации микроэлектрокортикографии высокой плотности (μEcoG) у крыс и мышей, включая хирургический, имплантационный и регистрирующий методы. Запись μECoG выполняется в сочетании либо с записью ламинарного политрода в слуховой коре крыс, либо с оптогенетическими манипуляциями нейронной активности в соматосенсорной коре мышей.

Как лаборатории исследуют, как активность мозга приводит к таким функциям, как восприятие и познание, используя ECOG и другие инструменты для связи локальной нейронной активности с корковыми сигналами в более широком масштабе.

Запись внеклеточных спайков в двухфотонной визуализации используется для измерения популяционной активности, но ECOG является одним из немногих методов, доступных как у людей, так и для фундаментальных исследований на животных.

Активность мозга охватывает множество пространственных и временных масштабов. Ни один сигнальный метод не может охватить их все сразу, но ECOG обладает достаточным временным и пространственным разрешением для решения многих критических вопросов.

Наш протокол устраняет ключевой пробел, объединяя ECOG с локальными записями и оптогенетикой, эффективно предоставляя микромасштабную информацию из сигналов мезомасштабной поверхности коры.

Полученные результаты позволят расширить использование ECOG в рамках мультимодальных экспериментальных парадигм для изучения фундаментальных принципов организации неокортикального мозга и выявления биомаркеров специфических функций коры головного мозга у человека.

[Инструктор] Для начала поместите мышь под наркозом на хирургическую кровать и с помощью пинцета приподнимите точку на коже над черепом. Затем, с помощью хирургических ножниц, рассекайте участок кожи диаметром примерно в один сантиметр. С помощью скребка очистите соединительную ткань и надкостницу от верхней части черепа. Смойте солевым раствором череп. Затем с помощью набора хирургических сверл на низкой скорости просверлите отверстие для заусенцев во фронтальной части полусферы ипсилатерально к регистрируемой области. Пробурите неглубокую траншею по периметру, чтобы определить контур трепанации черепа. Когда череп истончится до такой степени, что при очень легком давлении все окно заметно покачивается, удалите утонченную часть. Регулярно применяйте солевой раствор и используйте гемостатическую губку, чтобы поддерживать мозг влажным. Теперь вставьте серебряный контрольный провод примерно на один миллиметр в отверстие для заусенцев так, чтобы он соприкасался с поверхностью мозга, не вызывая кровотечения. После имплантации перекладины для головы поместите животное в установку для записи. Теперь прикрепите микроэлектрокортикографическую сетку к сцене с помощью разъемов с нулевым усилием введения. Удерживайте электронную плату над сценой на месте с помощью механической планки, закрепленной на микроманипуляторе. Опустите микроэлектрокортикографическую сетку горизонтально, чтобы выровнять ее по краниотомии вдоль переднезадней оси. Как только решетка приблизится к мозгу, не касаясь его, прикрепите контрольный провод решетки к имплантированному золотому штифту из серебряной проволоки. Далее опустите сетку дальше, чтобы установить контакт с мозгом. Переместите сетку в сторону, чтобы она скользила по влажной поверхности твердой мозговой оболочки, и продолжайте регулировку, пока она не будет центрирована вдоль медиолатеральной оси. Используйте аспирацию или хирургическую губку по краям трепанации черепа, чтобы удалить излишки физиологического раствора. Когда препарат немного подсохнет, убедитесь, что сетка прочнее прилегает к твердой мозговой оболочке и не скользит. Приложите к сетке латеральное или медиальное движение, чтобы обеспечить контакт с наиболее боковыми электродами, в то время как кабель сетки изгибается в соответствии с контуром мозга. Наблюдайте за электрофизиологической активностью с помощью записывающего программного обеспечения. Под легкой анестезией отслеживайте переменные паттерны сигналов мозга. Убедитесь, что сетка, опорный и заземляющий провода правильно подключены, чтобы обеспечить высокое соотношение сигнал/шум. Используйте программное обеспечение Trodes с полосовой фильтрацией в диапазоне от 300 до 6 000 Гц для мониторинга шума в высокочастотном диапазоне и обеспечения его сохранения в пределах десятков микровольт. Оцените сенсорную реакцию, генерируя шумовые стимулы, такие как хлопки в ладоши или щелканье пальцами, и наблюдайте за соответствующими электрическими потенциалами корковой поверхности. Включите оптогенетический свет с низкой интенсивностью, чтобы направить источник света и помочь расположить волокно, затем используйте шарнирный рычаг, чтобы примерно расположить оптогенетический свет по направлению к целевой области. Сфокусируйтесь и точно отрегулируйте положение волокна с помощью микроманипулятора или винтов точной регулировки перед записью сигналов. Чтобы очистить сетку, если мозг сухой, нанесите небольшую каплю физиологического раствора на поверхность мозга с помощью шприца и дайте ей постоять от 30 секунд до одной минуты, прежде чем поднять сетку. Работая под микроскопом, аккуратно приподнимайте сетку с поверхности мозга с помощью микроманипуляторов. Локализованная электрокортикографическая реакция наблюдалась примерно через 10 миллисекунд после стимуляции одним усом, с пиковой амплитудой отклонения около одного милливольта. Самая сильная реакция электродов была вызвана стимуляцией соответствующих усов, в то время как более слабая реакция или ее отсутствие наблюдалось при более отдаленных усе. Оптогенетическое торможение приводило к подавлению коркового ответа, вызванного усами, только у животных, экспрессирующих ингибирующие опсины. Оптоэлектрические артефакты проявились только при начале и смещении пятисекундной световой импульсной стимуляции с использованием волокна большого диаметра. Одномиллиметровое оптическое волокно создавало большой световой артефакт на микроэлектрокортикографической сетке, в то время как 200-микрометровое волокно значительно минимизировало этот артефакт. Записи микроэлектрокортикографии у крыс показали сильные слуховые реакции, с пиком примерно через 25-30 миллисекунд после стимула. В частотном спектре вызванного отклика наблюдались пики высокого гамма-излучения, сверхвысокого гамма-излучения и мультиюнитной активности, при этом высокий гамма-излучение был доминирующим компонентом. Микроэлектрокортикография записывалась вместе с записью ламинарного зонда. В политродных записях были обнаружены четкие спайковые волны, показывающие отчетливую форму волны по нескольким каналам. Графики амплитуды частотных характеристик от поверхностных электродов микроэлектрокортикографии близко совпадают с графиками амплитуд от электродов ламинарного политрода по всей глубине, демонстрируя последовательную слуховую настройку. Тонотопическая карта высокого разрешения, созданная на основе высоких гамма-сигналов, выявила функциональную организацию полей слуховой коры, включая первичную, заднюю и вентральную области.