Ампликонное секвенирование с использованием технологий длинносчитывательского секвенирования
29 августа 2025 г.
Этот протокол был оптимизирован для целенаправленного глубокого секвенирования 18 областей лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis с использованием платформы длинного секвенирования с последующим анализом с помощью биоинформатики, специфичной для туберкулеза, разработанной для длинных данных.
Я изучаю, может ли портативное секвенирование длинного чтения обеспечивать восприимчивость к туберкулёзу в условиях с ограниченными ресурсами с точностью, сопоставимой с методом золотых стандартов, способствуя доступной и качественной диагностике туберкулёза. Использование целевого секвенирования следующего поколения в качестве диагностического инструмента лекарственно-устойчивого туберкулёза путем предоставления комплексного профиля устойчивости непосредственно из клинических образцов без биоинформатики. Наш протокол, использующий секвенирование длинного чтения, обладает потенциалом обеспечить более короткие сроки выполнения, упростить рабочий процесс, чем в реальных временных методах обнаружения резистентности, облегчить комплексную диагностику туберкулёза и улучшить отслеживание вспышек в условиях ограниченных ресурсов и минимальной инфраструктуры.
Для начала рассчитайте 100 нанограммов каждого образца ампликона на основе концентрации и перенесите необходимый объём в чистую ПЦР-пробирку. Чтобы определить общую массу ампликонов в образце, используйте приведённую формулу. Отрегулируйте общий объём каждого образца до 12,5 микролитров с использованием воды без нуклеаз.
Аккуратно перемешайте образцы, пипетируя вверх и вниз 10 раз, и ненадолго прокрутите их в микроцентрифугах. Далее добавьте 1,75 микролитра буфера реакции для восстановления конца и аденилирования в каждый образец, затем 0,75 микролитра смеси ферментов для восстановления концов и аденилирования. После смешивания и вращения образцов поместите пробирки в термоциклер при 25 градусах Цельсия на 30 минут, затем на 65 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Для нативной лигации штрихкодов добавьте компоненты, отображаемые на экране, в новые ПЦР-трубки. Аккуратно смешайте реакции, пипетируя и коротко отвертая с помощью микроцентрифуга. Далее добавьте по одному микролитру ЭДТА в каждую трубку.
Затем тщательно перемешайте и ненадолго покрутите, как показывали ранее. Забирайте штрихкодированные образцы в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра. Вихрьте бусины для очистки ДНК, чтобы полностью их суспензировать и добавить объём, равный 0,7 объёму суммы образца.
Смешайте раствор для бусины и инкубуйте его на HulaMixer при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее, чтобы приготовить два миллилитра 80%этанола, смешайте 1 600 микролитров чистого этанола с 400 микролитрами воды без нуклеаз. Поставьте трубку на магнитную стойку на пять минут, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным.
Затем удалите и выбросьте супернатант, не трогая гранулу. Промыйте шарики 700 микролитрами свежеприготовленного 80% этанола и ненадолго центрифугуйте трубку. После установки трубки на магнитную стойку удалите остатки этанола.
Теперь снимите трубку из магнитной стойки. Слегка взвешивают шарики в 35 микролитрах воды без нуклеазы и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Верните трубку в магнитную стойку, пока элуат не станет прозрачным и бесцветным.
Затем переложите 35 микролитров элюата в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра для дальнейшего использования. Для переходной лигии смешивают указанные компоненты в 1,5-миллилитровой микроцентрифугной трубке с низким сцеплением. Кратковременно центрифугуйте трубку и инкубуйте при комнатной температуре 20 минут.
Вихрьте бусины для очистки ДНК, чтобы полностью их подвесить. Добавьте 20 микролитров шариков в пробирку и аккуратно перемешайте. Инкубировать на HulaMixer 10 минут при комнатной температуре.
Затем поместите трубку на магнитную решетку, чтобы гранулировать шарики и аспирировать супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте 125 микролитров буфера для коротких фрагментов и аккуратно подведите трубку, чтобы подвесить шарики. Ненадолго центрифугуйте и верните лампу в магнитную стойку.
Аспирируйте супернатант снова после того, как шарики будут гранулированы. Теперь вынимите трубку с магнитной стойки и подвесите шарики в 15 микролитрах буфера элюции, аккуратно пипетируя или щелкая. Кратко центрифугуйте трубку, чтобы собрать содержимое, затем инкубировать её при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы элюировать ДНК.
Поставьте трубку на магнитную стойку, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным. Затем аспирируйте 15 микролитров элюата и передайте его в чистую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра. Для подготовки раствора для запуска потоком ячейки тщательно перемешайте заданные компоненты.
Откройте запусковой порт потоковой ячейки, впустите примерно 20 микролитров буфера для удаления пузырьков воздуха и загрузите 800 микролитров смеси для запуска в порт без появления пузырьков воздуха. Чтобы подготовить библиотеку ДНК, тщательно перемешайте компоненты, показанные на экране. Аккуратно поднимите крышку порта проба потоковой ячейки, загрузите 200 микролитров смеси для прайма в порт без появления пузырьков воздуха.
После смешивания подготовленной библиотеки ДНК загрузите 75 микролитров библиотеки по капле в порт образца секвенирующих потоковых ячеек. Закройте крышку порта образца проточной ячейки, убедившись, что пучок надёжно входит в отверстие, а затем плотно закройте порт для запуска. Гель-электрофорез подтвердил целостность ампликона почти во всех образцах, но линии, соответствующие образцам 89 и 136, показали слабые или отсутствующие полосы.
Образцы 89 и 136 имели недостаточную концентрацию ампликонов, что привело к их исключению из секвенирования длинного чтения. По всем целевых генам платформы длинного и короткого чтения достигли высокой глубины покрытия: ген EIS показал самые высокие средние значения, а ген RRS — наименьшую глубину покрытия. Несмотря на широкий диапазон глубины покрытия, обе платформы сохраняли высокую ширину покрытия — 99,9% по всем генам, ассоциируемым с резистентностью.
Варианты лекарственной резистентности для этамбутола, фторхинолонов, канамицина, амикацина и капреомицина были выявлены с 100% согласованностью на платформах секвенирования с коротким и длинным чтением. Мутации, связанные с резистентностью, для линезолида, бедаквилина и клофазамина при использовании ни одного из методов секвенирования, не были обнаружены. Обнаружение стойкости стрептомицина показало меньшую согласованность между платформами — всего 71,43%.
Чувствительность к обнаружению ключевых генов rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA и pncA варьировалась от 89,47% до 96,77% между платформами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование исследует использование переносимого секвенирования длинных считываний для определения устойчивости к лекарствам при туберкулезе (ТБ) в условиях с ограниченными ресурсами. Протокол направлен на обеспечение точных результатов, сопоставимых с методами "золотого стандарта", улучшая доступную диагностику ТБ.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Геномика
- Инфекционные болезни
Предпосылки
- Устойчивость к лекарствам при туберкулезе является значительной глобальной проблемой здравоохранения.
- Традиционные методы диагностики могут быть ограничены в условиях с недостатком ресурсов.
- Секвенирование длинных считываний предлагает потенциальные преимущества в точности и сроках выполнения.
- Экспертиза в области биоинформатики часто является барьером для эффективной диагностики.
Цель исследования
- Оценить эффективность секвенирования длинных считываний для диагностики ТБ.
- Обеспечить комплексный профиль устойчивости из клинических образцов.
- Упростить рабочий процесс обнаружения устойчивости к лекарствам.
Используемые методы
- Целевое секвенирование следующего поколения 18 регионов, связанных с устойчивостью к лекарствам.
- Использование специализированного биоинформатического пайплайна для туберкулеза.
- Подготовка образцов с точным измерением амплификатов.
- Корректировка объемов образцов для оптимальных результатов секвенирования.
Основные результаты
- Секвенирование длинных считываний продемонстрировало точность, сопоставимую с "золотыми стандартами".
- Были достигнуты более короткие сроки выполнения по сравнению с традиционными методами.
- Протокол облегчил комплексную диагностику ТБ.
- Было возможно улучшенное отслеживание вспышек в условиях с ограниченными ресурсами.
Выводы
- Переносимое секвенирование длинных считываний может улучшить диагностику ТБ в условиях с ограниченными ресурсами.
- Метод уменьшает необходимость в обширной биоинформатической экспертизе.
- Этот подход имеет потенциал для трансформации стратегий управления и контроля ТБ.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
