3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Общая цель данного метода заключается в захвате и секвенировании 3'-концов мРНК, что позволяет изучать процессинг мРНК, в частности расщепление 3'-конца и полиаденилирование, а также проводить количественную оценку экспрессии генов. Представленный здесь протокол A-seq2 и пакет для анализа данных могут помочь ответить на ключевые вопросы о возникновении и функции изоформ транскриптов в различных типах клеток и тканей. Основными преимуществами метода A-seq2 являются исключение секвенирования длинных поли(A)-трактов и отсутствие образования димеров адаптеров.

Для данной процедуры используют клетки, выращенные до 80% конфлюэнтности. Удалите питательную среду и один раз промойте клетки PBS. Лизируйте клетки непосредственно в лунке, добавив один миллилитр лизирующего буфера на каждую лунку, и с помощью резинового шпателя полностью отделите клеточный материал от поверхности планшета.

С помощью наконечника дозатора объемом 1 мл перенесите вязкий лизат из каждой лунки в пластиковую пробирку объемом 15 мл. Перемешайте ДНК, используя шприц объемом 1 мл с установленной гиподермической иглой 23 G. Несколько раз интенсивно перемещайте поршень вверх и вниз до тех пор, пока лизат не перестанет быть вязким.

Перенесите лизат в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 20 000 ×g и 4 °C в течение пяти минут для удаления клеточного дебриса. Соберите прозрачный супернатант из лизата.

Добавьте магнитные бусины oligo d(T)25 и ресуспендируйте смесь. Поместите пробирки на ротатор на 10 минут. Затем поместите пробирки на магнитный сепаратор на две минуты.

Удалите прозрачную жидкость. Добавьте по 0,8 milliliters буфера A в каждую пробирку и переверните пробирку на 180 градусов два-три раза. Удалите буфер A после второй промывки.

Добавьте по 0.8 milliliters буфера B в каждую пробирку и оставьте их в штативе на две минуты. Чтобы элюировать связавшуюся мРНК с гранул, удалите буфер B, добавьте по 33 microliters воды в каждую пробирку и ресуспендируйте гранулы. Нагрейте до 75 degrees Celsius в течение пяти минут на термоблоке.

Сразу после этого центрифугируйте пробирки в течение одной секунды и поместите их на магнитный штатив. Перенесите супернатант в новую пробирку. Добавьте в каждую пробирку 66 µL буфера для щелочного гидролиза, перемешайте и нагревайте при 95 °C ровно пять минут на термоблоке.

Немедленно охладите пробирки на льду. Затем проведите выделение РНК с помощью набора для очистки РНК, как описано в текстовом протоколе. Для начала этой процедуры добавьте в каждый образец РНК 14 microliters Master Mix полинуклеотидкиназы.

Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. По истечении 30 минут нанесите киназные реакции на подготовленные спин-колонки. Центрифугируйте колонки при 735 ×g в течение двух минут.

Удалите колонки и поместите пробирки со собранными продуктами реакций на лед. Чтобы заблокировать три 3'-конца фрагментов РНК и предотвратить их конкатемеризацию в последующих реакциях лигирования, добавьте в каждый образец 17,5 microliters мастер-смеси поли(А)-полимеразы. Перемешайте и центрифугируйте в течение одной секунды.

Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. По истечении 30 минут добавьте в каждую реакционную смесь 32,5 µL воды и очистите РНК согласно текстовому протоколу. Начните эту процедуру с помещения пробирок в вакуум-концентратор на 10 минут, чтобы уменьшить объем до 6 µL.

Затем добавьте в каждую реакционную смесь 24 µL мастер-микса РНК-лигазы. Инкубируйте смеси на нагреваемом миксере при 24 °C в течение 16 часов с периодическим перемешиванием при 1000 RPM. На следующий день добавьте в каждую реакцию 17 µL воды и перемешайте.

Очистите РНК согласно текстовому протоколу. Поместите элюаты в вакуум-концентратор на три минуты, чтобы уменьшить объем до 11 µL. Перенесите реакционные смеси в ПЦР-пробирки объемом 200 µL для проведения реакции обратной транскрипции.

Добавьте 1 µL праймера. Нагрейте в ПЦР-циклере при 70 °C в течение пяти минут, затем оставьте при комнатной температуре на пять минут. Добавьте в каждую пробирку 8 µL мастер-микса для обратной транскрипции и перемешайте.

Поместите пробирки в амплификатор. Нагрейте до 55 °C в течение 10 минут, а затем до 80 °C еще на 10 минут. Храните на льду.

Подготовьте стрептавидин-беды согласно текстовому протоколу. Добавьте смесь для реакции обратной транскрипции к раствору с бедами и инкубируйте при температуре 4 °C на ротаторе в течение 20 минут. Используя магнитный сепаратор, промойте беды дважды буфером для связывания биотина и дважды буфером TEN.

Ресуспендируйте гранулы в 50 µL буфера TEN. Добавьте два µL смеси фермента урацил-ДНК-гликозилазы и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа в миксере с периодическим перемешиванием. В каждую реакционную смесь добавьте 50 µL воды, 11 µL буфера для РНказы H и один µL РНказы H.

Инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут. Поместите пробирки на магнитный штатив и перенесите жидкость, содержащую расщепленную кДНК, в новую пробирку. Очистите расщепленную кДНК с помощью набора для очистки продуктов ПЦР, как описано в текстовом протоколе.

Поместите очищенную кДНК в вакуум-концентратор на восемь минут, чтобы сконцентрировать ее до объема 7 µL. Для лигирования 5'-адаптеров к 5'-концам выделенной кДНК добавьте в каждый образец 23 µL мастер-микса РНК-лигазы и инкубируйте при 24 °C в течение 20 часов. В завершение добавьте по 70 µL воды в каждую реакционную смесь.

Проводится пилотная ПЦР для определения оптимального количества циклов ПЦР, необходимых для амплификации библиотеки в пределах экспоненциальной фазы. В ПЦР-пробирку объемом 200 µL внесите следующее: 25 µL смеси ДНК-полимеразы, 20 µL реакции лигирования, 2 µL воды, 1,5 µL прямого ПЦР-праймера и 1,5 µL обратного ПЦР-индексного праймера. Запустите амплификатор по следующей программе: три минуты при 95 °C, затем 20 циклов по 20 секунд при 98 °C, 20 секунд при 67 °C и 30 секунд при 72 °C.

Соберите аликвоты объемом 7 µL непосредственно из амплификатора после указанных циклов. Разделите продукты в 2% агарозном геле и визуализируйте миграцию продуктов ПЦР. Определите количество циклов в начале экспоненциальной амплификации (в данном примере — 12 циклов) и используйте это количество циклов для проведения ПЦР в большом масштабе.

Проведите разделение продуктов ПЦР в большом масштабе на 2% агарозном геле и вырежьте фрагменты геля, содержащие продукты ДНК размером от 200 до 350 нуклеотидов. Впоследствии экстрагируйте ДНК из фрагментов геля с помощью набора для экстракции из геля, как описано в текстовом протоколе. В данном видео будут показаны только наиболее важные этапы вычислений.

Более подробная информация представлена в текстовом протоколе. Начните с клонирования Git-репозитория и перехода в только что созданный каталог. Создайте среду, содержащую необходимое программное обеспечение, и активируйте эту среду.

Загрузите последовательность генома организма, для которого были получены данные A-seq2. Откройте конфигурационный файл и установите входные параметры в соответствии с текстовым протоколом. Запустите анализ.

Реакция специфического гена NUP214 на нокдаун белка HNRNPC была изучена путем анализа ридов a-seq2 из двух образцов клеток HEK-293, обработанных либо контрольной малой интерферирующей РНК, либо малой интерферирующей РНК против HNRNPC. Риды, документирующие поли(А)-сайты, аннотированные конвейером анализа, были сохранены в формате BAM, который использовался в качестве входных данных для геномного браузера IGD. 3'-концы пиков ридов были картированы на 3'-концы мРНК, аннотированные в Ensembl.

Профили указывают на повышенное использование изоформы с длинным 3'-UTR после нокдауна HNRNCR. После освоения протокол A-seq занимает восемь часов активной работы или примерно два-три дня, не считая времени на культивирование клеток и ночные лигирования. При выполнении протокола важно сначала разработать набор праймеров, соответствующий платформе секвенирования, используемой в вашем учреждении.

После получения 3'-концов мРНК можно применить другие методы, такие как кросс-линкинг и иммунопреципитация, для идентификации регуляторов процессинга 3'-концов пре-мРНК. Метод A-seq2 открыл исследователям в области процессинга РНК возможность изучить регуляцию и последствия альтернативного полиаденилирования в отдельных типах клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать библиотеки 3'-концов мРНК, анализировать данные секвенирования, идентифицировать новые поли(А)-сайты и количественно оценивать частоту их использования.

Мы надеемся, что A-seq2 облегчит вашу работу по изучению регуляции процессинга мРНК и приведет к множеству новых открытий.