3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Этот протокол описывает метод для сопоставления пре мРНК 3' конца обработки сайтов.

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы захватить и секвенировать три основных конца мРНК, тем самым, что позволяет изучать процессинг мРНК, в частности, расщепление трех основных концов и полиаденилирование, а также количественную оценку экспрессии генов. Представленный здесь протокол A-seq2 и пакет анализа данных могут помочь ответить на ключевые вопросы о генерации и функционировании изоформ транскриптов в различных типах клеток и тканях. Основные преимущества метода A-seq2 заключаются в том, что он позволяет избежать секвенирования через длинные поли(А)растяжки и не генерирует димеры адаптера.

Для этой процедуры используются клетки, выращенные до 80% конфлюенции. Удалите питательную среду и промойте клетки один раз PBS. Непосредственно лизируйте клетки на планшете, добавив один миллилитр буфера для лизиса на лунку и используя резиновый шпатель, чтобы полностью отделить материал клетки от поверхности пластины.

С помощью наконечника для пипетки объемом один миллилитр переведите вязкий лизат из каждой лунки в пластиковую пробирку объемом 15 миллилитров. Поделитесь ДНК с помощью одномиллилитрового шприца, прикрепленного к игле для подкожных инъекций 23 калибра. Выполните несколько энергичных движений поршнем вверх и вниз, пока лизат не перестанет быть вязким.

Переложите лизат в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Вращайте при температуре 20 000 раз больше g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы удалить мусор. Соберите прозрачную надосадочную жидкость из лизата.

Добавьте к олиго d(T)25 магнитные шарики и повторно суспендируйте смесь. Поместите трубки на вращающееся колесо на 10 минут. Далее поместите трубки на магнитную решетку на две минуты.

Удалите прозрачную жидкость. Добавьте в каждую трубку по 0,8 миллилитра буфера А и поверните трубку на 180 градусов два-три раза. Снимите буфер А со второй промывки.

Добавьте в каждую пробирку по 0,8 миллилитра буфера В и оставьте на решетке на две минуты. Чтобы вымыть связанную мРНК из шариков, удалите буфер В, добавьте 33 микролитра воды в каждую пробирку и снова суспендируйте шарики. Нагрейте до 75 градусов Цельсия в течение пяти минут на глыбе.

Сразу же вращайте трубки в течение одной секунды и поместите их на магнитную решетку. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Добавьте 66 микролитров щелочного гидролизного буфера в каждую пробирку, перемешайте и нагревайте при температуре 95 градусов Цельсия ровно пять минут на нагревательном блоке.

Сразу же охладите трубки на льду. Затем выполните выделение РНК с помощью набора для очистки РНК, как описано в текстовом протоколе. Чтобы начать эту процедуру, добавьте в каждый образец РНК по 14 микролитров полинуклеотидкиназы Master Mix.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут загрузите киназные реакции на подготовленные спиновые колонки. Вращайте колонны в 735 раз g в течение двух минут.

Выбросьте колонки и поместите на лед пробирки с собранными реакциями. Чтобы блокировать три основных конца фрагментов РНК и избежать их конкатемизации в последующих реакциях лигирования, добавьте к каждому образцу 17,5 микролитров мастер-микса поли(А)полимеразы. Перемешайте и вращайте в течение одной секунды.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут добавьте по 32,5 микролитра воды в каждую реакцию и очистите РНК, как описано в текстовом протоколе. Начните эту процедуру, поместив реакции в вакуумный концентратор на 10 минут, чтобы уменьшить объем до шести микролитров.

Затем добавьте в каждую реакцию по 24 микролитра РНК-лигазы Master Mix. Инкубируйте реакции в нагретом смесителе при температуре 24 градуса Цельсия в течение 16 часов, с прерывистым перемешиванием со скоростью одна тысяча оборотов в минуту. На следующий день добавьте по 17 микролитров воды в каждую реакцию и перемешайте.

Очистите РНК, как описано в текстовом протоколе. Поместите элюиты в вакуумный концентратор на три минуты, чтобы уменьшить объем до 11 микролитров. Перенесите реакции в 200 микролитровые ПЦР-пробирки для реакции обратной транскрипции.

Добавьте один микролитр грунтовки. Нагрейте до 70 градусов Цельсия в амплификаторе для ПЦР в течение пяти минут, а затем оставьте при комнатной температуре на пять минут. Добавьте восемь микролитров мастер-микса с обратной транскрипцией в каждую пробирку и перемешайте.

Поместите пробирки в амплификатор для ПЦР. Нагреваем до 55 градусов Цельсия в течение 10 минут и до 80 градусов Цельсия еще 10 минут. Держите на льду.

Приготовьте бусины стрептавидина, как описано в текстовом протоколе. Добавьте в раствор гранул реакцию обратной транскрипции и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия на вращающемся колесе в течение 20 минут. С помощью магнитной решетки дважды промойте бусины с буфером для связывания биотина и дважды с буфером TEN.

Суспендируйте шарики в 50 микролитрах буфера TEN. Добавьте два микролитра смеси ферментов урацил ДНК-гликозилазы и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа в миксере, с прерывистым перемешиванием. Добавьте 50 микролитров воды, 11 микролитров буфера РНКазы H и один микролитр Rnase H в каждую реакцию.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Поместите пробирки на магнитный штатив и перенесите жидкость, содержащую расщепленную кДНК, в новую пробирку. Очистите расщепленную кДНК с помощью набора для очистки ПЦР, как описано в текстовом протоколе.

Поместите очищенную кДНК в вакуумный концентратор на восемь минут, чтобы она сконцентрировалась до объема семь микролитров. Чтобы лигировать пять первичных адаптеров к пяти основным концам выделенной кДНК, добавьте к каждому образцу 23 микролитра мастер-микса РНК-лигазы и инкубируйте при 24 градусах Цельсия в течение 20 часов. Наконец, добавьте 70 микролитров воды в каждую реакцию.

Пилотная ПЦР проводится для определения оптимального количества циклов ПЦР для достижения амплификации библиотеки в экспоненциальной фазе. Пипеткой в ПЦР-пробирку объемом 200 микролитров введите: 25 микролитров смеси ДНК-полимеразы, 20 микролитров реакции лигирования, два микролитра воды, 1,5 микролитра праймера для прямой ПЦР и 1,5 микролитра праймера для обратной ПЦР. Запустите циклер по следующей программе: три минуты при 95 градусах Цельсия, затем 20 циклов по 20 секунд при 98 градусах Цельсия, 20 секунд при 67 градусах Цельсия и 30 секунд при 72 градусах Цельсия.

Соберите семь микролитров аликвот прямо из амплификатора, после указанных циклов. Разделите продукты на 2%-ном агарозном геле и визуализируйте миграцию продуктов ПЦР. Определите количество циклов в начале экспоненциальной амплификации, 12 циклов в этом примере, и используйте это количество циклов для крупномасштабной ПЦР-реакции.

Отделите продукты от крупномасштабной ПЦР-реакции на 2%-ном агарозном геле и вырежьте срезы геля, содержащие от 200 до 350 нуклеотидных продуктов ДНК. Затем извлеките ДНК из срезов геля с помощью набора для экстракции геля, как описано в текстовом протоколе. В этом видео будут показаны только самые важные вычислительные шаги.

Более подробная информация доступна в текстовом протоколе. Начните с клонирования репозитория Git и перехода на только что созданный каталог. Создайте среду, содержащую программное обеспечение, и активируйте эту среду.

Загрузите последовательность генома организма, из которого были получены данные A-seq2. Откройте файл конфигурации и задайте входные параметры, как указано в текстовом протоколе. Начните анализ.

Реакция специфического гена NUP214 на нокдаун белка HNRNPC была изучена путем анализа прочитанных a-seq2 двух образцов клеток HEK-293, обработанных либо контрольной малой интерферирующей РНК, либо малой интерферирующей РНК HNRNPC. Чтения, которые документировали поли(А)сайты, аннотированные конвейером анализа, были сохранены в формате BAM, который использовался в качестве входных данных для браузера генома IGD. Три простых конца считанных пиков, отображенных на мМРНК, три простых конца, которые аннотированы в ансамбле.

Профили указывают на более широкое использование изоформы длинных трех простых чисел UTR при нокдауне HNRNCR. После освоения протокол A-seq занимает восемь часов ручного времени или около двух-трех дней, не считая времени на культивирование клеток и ночные лигирования. При использовании протокола важно сначала разработать основной набор, соответствующий платформе секвенирования, используемой в вашем регионе.

После того, как вы получили три основных конца мМР, можно использовать другие методы, такие как сшивание и иммунопреципитация, для идентификации регуляторов процессинга трех основных концов пре-мРНК. A-seq2 проложил путь исследователям в области процессинга РНК к изучению регуляции и последствий альтернативного полиаденилирования в отдельных типах клеток. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как создавать библиотеки мРНК с тремя основными концами, анализировать данные секвенирования, выявлять новые поли(А)сайты и количественно оценивать их использование.

Мы надеемся, что A-seq2 облегчит вашу работу по началу регуляции процессинга мРНК и приведет к многим новым открытиям.