Моделирование метастазов в мозг: стандартизированный анализ метастатической колонизации и гистологических ростовых паттернов с помощью стереотаксической интракортикальной инъекции

Наша группа исследует, как опухолевые клетки колонизируют мозг и как метастатические паттерны роста влияют на клинические результаты и ответы на лечение. Для начала взвесьте каждую мышь с помощью точных весов, чтобы рассчитать необходимый объём анестетика с учетом её массы тела. После введения анестетика положите мышь на заранее тёплую грелку, поддерживаемую при температуре 37–38 градусов Цельсия для терморегуляции, затем нанесите глазную мазь для защиты роговицы от высыхания.

Подготовьте мышь с помощью асептической техники, одобренной местным комитетом по этике животных. Тщательно продезинфицируйте кожу головы с помощью раствора на основе йода. Подтвердите глубину анестезии с помощью защипки пальца, затем растяните кожу и сделайте разрез по средней линии примерно на три-четыре миллиметра вдоль черепа с помощью стерильного скальпеля.

С помощью того же скальпеля аккуратно соскрести надственность, чтобы обнажить поверхность черепа. Зафиксируйте голову мыши в стереотактической раме с помощью наушников. Используя стереотаксическую руку, определите брегму, затем переместите руку на два миллиметра вперёд и один миллиметр латерально вправо, и отметьте цель в лобной коре хирургическим маркером.

Аккуратно просверлите череп в отмеченном месте с помощью прецизионного стоматологического сверлителя, чтобы твердая мозговая смесь не была пробита. Проверьте отверстие, аккуратно прощупывая место стерильными щипцами. Далее подвесьте суспензию опухолевых клеток, проводя пипеты вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение.

Загрузите три микролитра подвески в 10-микролитровый шприц Hamilton и поместите его в стереотактическую раму с помощью соответствующего держателя. Аккуратно разместите иглу шприца над отверстием для инъекции, убедившись, что фаска направлена влево для консистенции инъекций. Введите иглу вертикально в ткань мозга на глубину 3,5 миллиметра.

После достижения нужной глубины медленно убрате иглу на 0,5 миллиметра, чтобы предотвратить рефлюкс клеточной суспензии, и медленно вводите три микролитра суспензии опухолевой клетки в течение одной минуты. После инъекции держите иглу на месте ещё две минуты, чтобы клетки и внеклеточная матрица успокоились и минимизировали рефлюкс. Затем аккуратно вынимите шприц и выньте мышь из стереотаксической рамки.

Аккуратно промыйте череп стерильным раствором хлорида натрия 0,9% и запечатайте отверстие костного воска. Закройте разрез на коже головы тремя-четырьмя швами, завязывая каждый шов тремя тугими узлами близко к краям раны для оптимального заживления. Отметьте уши мыши соответствующим рисунком пробивания, соответствующим назначенному номеру идентификации.

Затем, если нужно, нанесите глазную мазь повторно, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановления, и верните мышь в предварительно тёплую грелку с температурой 37–38 градусов Цельсия для облегчения восстановления после наркоза. Тщательно очистите и продезинфицируйте шприц Hamilton, промывая иглу и ствол три раза подряд: сначала дистиллированной водой, затем 70% этанола, и, наконец, стерильным раствором хлорида натрия 0,9%. После промывания храните шприц Hamilton на льду до следующего использования.

Наконец, введите обезболивающее подкожно, пока мышь ещё находится под наркозом, чтобы обеспечить немедленное облегчение боли после операции. Домашних мышей индивидуально во время восстановления на короткое время, не более одного часа, чтобы предотвратить травмы от взаимодействия бодрствующих и выздоравливающих животных. Если в период мониторинга наблюдаются признаки дискомфорта или аномального поведения, оцените неврологическую функцию с помощью теста с висящей проволокой для оценки силы и координации хвата.

Подвесьте мышь на горизонтальном проводе и запишите, достигнет ли она платформы для спасения в течение 60 секунд. Нездоровая мышь не успевает дотянуться до платформы и падает с троса. После эвтаназии и сбора тканей животных оцените гистологический паттерн роста метастазов и связанные с ними характеристики на цифровых тканевых слайдах.

Макроскопические изображения подтвердили отсутствие роста опухоли у мышей с контрольным клапаном C, введённых в ЭКМ, в то время как видимые метастазические поражения были обнаружены у мышей, введённых суспензиями ЭКМ опухолевых клеток. Мыши, введенные клетками рака молочной железы 4T1 или 410,4, показали значительно более высокую метастатическую нагрузку по сравнению с контрольными группами, введёнными ЭКМ, при отсутствии значимой разницы между двумя линиями опухолевых клеток. Анализ выживаемости Каплана Мейера показал, что мыши, введённые 410,4 опухолевых клеток, имели значительно более длительную выживаемость по сравнению с теми, кто получил клетки 4T1.

Гистологический анализ показал, что метастазы в мозге 4T1 и 410.4 демонстрировали характерные паттерны роста: 4T1 — когортнообразный, а 410.4 — цепочкоподобный эпителиальный инфильтративный рост. Неправильная стереотаксическая инъекция приводила к росту опухолей в черепе и мозговых мозгах из-за утечки суспензии клеток, тогда как правильная интракортикальная инъекция приводила к метастазированию паренхимы с последующим менингеальным распространением. Мы показали, что паттерны роста метастазов в мозге влияют на прогноз и неврологическую смерть, что подтверждает значимость для руководства клиническими решениями.

Этот протокол особенно полезен для изучения поздней стадии метастазической колонизации, учитывая клинически значимые аспекты, такие как динамика роста и вторичное распространение. В отличие от других методов, стереотаксическая модель обеспечивает колонизацию специфического мозга и сохраняет полную сложность системы, что позволяет проводить долгосрочные исследования прогрессирования опухоли и терапии. Предоставляя воспроизводимую клинически значимую платформу, наша модель способствует пониманию механизмов колонизации мозга и исследованию новых терапевтических стратегий.