Мультилабораторная модель тромбоэмболического инсульта с тромболизом Сети доклинической оценки инсульта: TE-MCAo

Цель наших исследований — разработать модель тромбоэмболического инсульта с контролируемым тромболизом для использования в строгих многолабораторных доклинических терапевтических испытаниях. Наш протокол учитывает отсутствие простой воспроизводимой модели тромбоэмболического инсульта, имитирующей клинический тромболиз и поддерживающей многоцентровые доклинические испытания. Для начала опракивайте трубку PE-50, обрезая конец под скошенным углом.

Обрежьте самый кончик конической точки с помощью микроножниц. После подготовки анестезиированной крысы к операции сделайте вертикальный разрез на внутренней стороне бедра длиной примерно 1,5–2 сантиметра вдоль естественной складки пахового пересечения с ногой. Разрез должен быть ортогонален ожидаемому анатомическому курсу бедренной артерии.

С помощью тупой вскрытия аккуратно вскрытие до бедренных сосудов. Затем отдельте бедренную артерию от вены и нерва, которые проходят в одном пучке. Скелетизуйте бедренную артерию как можно дальше проксимальной, прослеживая артерию до её ретроперитонеального происхождения.

Свободно наместите петлю из 5-0 шелка вокруг бедренной артерии и используйте хвосты для мягкого натяжения проксимального конца артерии. Затем дистально перекройте бедренную артерию шелковой связкой 5-0 и используйте хвосты шва для небольшого напряжения дистально гемостатическими зажимами. Примерно на две трети расстояния от проксимальной петли шва положите кусок шелкового шва под артерию и с помощью микроножниц сделайте небольшой артериотомический участок дисталь от свободного шва.

Используя острые щипцы, поднимите верхнее отверстие артериотомии и введите тупо-скошенный катетер PE-50 в отверстие. Продвигайте катетер максимально проксимально, чтобы ослабленная петля при затянии охватывала катетер. Аккуратно затяните шов, чтобы он не закрывает катетер и не сидит на фаске.

Освободите резиновый зажим. Катетер должен немедленно наполниться кровью. Заполните три центрифугных трубки по 1,5 миллилитра и храните их при 4 градусах Цельсия.

После заполнения трубок удалите катетер PE-50 из бедренной артерии, перевяжите проксимальный конец и закройте разрез прерванными 5-0 проленовыми швами. Для подготовки тромба переведите 500 микролитров свежевзятой или хранящейся донорской крови в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра и добавьте один миллилитр хлорида кальция для отмены антикоагулянтного эффекта. Затем немедленно аспирировать кровь из микроцентрифугной трубки в трубку PE-50 диаметром 100 сантиметров с мягким всасыванием и инкубировать спиральную трубку в предварительно подогретой PBS при 37 градусах Цельсия в течение двух часов в настольной духовке.

После того как тромб выбросил в чашку Петри с PBS, разрежьте её на секции примерно шесть сантиметров с помощью лезвия бритвы. Аккуратно втяните каждый тромб в катетер PE-50 и полностью выпустите его пять раз, чтобы промыть. Промыйте тромб ещё раз, аккуратно втянув его в катетер PE-10 и полностью выпустив 15 раз.

Добавьте 200 микролитров синего цвета 4% Эванса в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров PBS, чтобы получить разбавление номер 1. Затем пипетить 400 микролитров разбавления номер 1 в отдельную чашку Петри с 20 миллилитрами PBS, чтобы получить разбавление номер 2. Поместите сгусток в более концентрированный раствор чашки Evans blue Petri на одну секунду, затем переложите его в разбавленную чашку Evans blue Petri.

Загрузите один промытый тромб в готовые микрокатетеры без воздушных эмболов, используя метод «мокрый к влажности». Когда тромб полностью загрузится, вытяните достаточно тромба, чтобы в микрокатетере оставалось ровно пять сантиметров. Обрежьте лишнее место лезвием бритвы.

Отметьте микрокатетер на расстоянии 16 миллиметров от кончика, чтобы определить объём катетера, который следует продвигать внутри света. Предварительно нагруженные тромбоэмболи были введены во внутреннюю сонную артерию 135 участников в шести исследовательских лабораториях для проверки возможности модели окклюзии тромбоэмболической средней церебральной артерии. Магнитно-резонансная томография была проведена через три дня у 102 животных, что показало 75% завершения сканирования.

Потеря животных до проведения визуализации была стабильной во всех шести лабораториях. Средний объём поражения по всем участкам составлял 13% от ипсилатерального полушария, с некоторыми вариациями между шестью лабораториями. Наш протокол имитирует человеческий тромб и тромболиз, снижает использование животных, стандартизирует хирургическое вмешательство и обеспечивает надёжную многоцентровую воспроизводимость.

В качестве значимого результата нашего исследования мы создали масштабируемую воспроизводимую модель TE-MCAo, которая может применяться в нескольких лабораториях с единообразными результатами и структурированным контролем качества. Эта модель может последовательно применяться как в одиночных, так и в многолабораторных исследованиях инсульта, улучшая терапевтический скрининг и ускоряя трансляцию кандидатов на церебральные защитные методы.