Морфометрический анализ формы: инструментарий для анализа для количественного определения черепно-лицевой формы у данио-рерио.
February 27th, 2026
В данной работе описывается протокол количественной оценки формы краниофациального хряща с помощью бесплатного программного обеспечения (tpsDigs2, MorphoJ и PAST) для измерения изменений структуры лица у личинок данио-рерио.
Наши исследования используют морфометрическое программное обеспечение для количественного определения, взаимодействуют ли этанол и bmp7a, вызывая тонкие черепно-лицевые дефекты у данио-рерио. Линейные меры пропускают тонкие изменения. С помощью этого метода мы используем ориентиры для количественной оценки изменений формы, учитывая различия в размерах.
Для начала откройте программное обеспечение tpsDigs2. Нажмите Input source, затем File и выберите сохранённый файл TPS Notepad. Нажмите «Параметры», чтобы визуализировать опцию «Инструменты изображения».
Установите опорную длину на 100 микрометров и нажмите на шкале Set. Нажмите OK, чтобы подтвердить параметры масштаба, затем выйдите из окна инструментов изображения. Затем нажмите на символ прицеливания и поставьте первый ориентир на средний сустав между хрящами Меккеля.
Разместите вторые ориентиры в двусторонних суставах между хрящами Меккеля и небёцоквадровым хрящем. Разместите третий ориентир в среднем суставе между цератогиальными хрящами, а четвёртый — в двусторонних суставах между небёчноквадратным и цератогиальным хрящами. Затем разместите пятые ориентиры на дистальной стороне гиомандибулярных хрящей, чтобы ориентиры были расположены в одном порядке для каждого изображения.
После размещения ориентиров нажмите «Файл», чтобы открыть выпадающее меню. Выберите «Сохранить данные», а затем «Перезаписать», чтобы сохранить обновлённый файл. Выйдите из программы tpsDigs2.
Запустите программное обеспечение MorphoJ. Нажмите «Файл», выберите «Создать новый набор данных» и присвоите имя набору данных. Нажмите TPS и выберите файл блокнота, содержащий недавно добавленные данные.
Затем создайте набор данных. В Дереве проектов нажмите на набор данных. Выберите предварительные этапы, затем подгоняйте новые Прокрусты.
Выберите «Выровнять по главным осям» и нажмите «Выполнить подход Прокруста». В разделе Предвариальные параметры выберите Generate Covariance Matrix, чтобы получить координаты прокруста. Выполняйте функцию по запросу.
Теперь выберите Создать или Редактировать Wireframe и свяжите точки на изображениях. Кликайте по связанным точкам, принимайте или создайте изображение, затем редактируйте классификаторы по необходимости. Откройте программу с таблицами, оставив MorphoJ открытым.
Введите информацию о классификаторе, такую как GENOTYPE, TREATMENT и GENOTYPE TREATMENT, затем сохраните файл как CSV-файл. В MorphoJ нажмите File и выберите Import Classifier Variables, чтобы импортировать CSV-файл. Вернитесь в Дерево проектов и кликните по набору данных.
В разделе «Предварительные» выберите «Редактировать классификаторы», чтобы убедиться, что все изображения включены. В Дереве проектов выберите CovMatrix, затем нажмите Variation в верхней части страницы. Выберите Анализ основных компонентов для расчёта оценок основных компонентов.
Нажмите на PC scores, чтобы показать сгенерированный график. Кликните правой кнопкой мыши по графику и выберите Confidence Ellipsis, чтобы добавить нужный классификатор. Выберите точки цветовых данных, назначьте цвета и нажмите OK, чтобы применить изменения.
В разделе «Предварительные параметры» выберите «Настройки для графа форм», расположенного внизу экрана. Выберите Wireframe Graphs и измените цвета целевой формы, начальной формы и чисел. Выберите вариацию, затем выберите прокруст ANOVA.
Экспортировать результаты ANOVA procrustes в ранее созданный файл таблицы. В MorphoJ выберите исходный набор данных в Project Tree. Нажмите «Сравнение», затем «Канонический вариантный анализ».
Выберите переменную классификатора GENOTYPE TREATMENT и выполните функцию. Чтобы экспортировать результаты, нажмите на вкладку «Результаты» и кликните правой кнопкой мыши на странице результатов. Выберите «Экспортировать в файл» и сохранить результаты.
В проектном дереве выберите канонический вариантный анализ, затем оценивайте оценки. Нажмите «Файл», выберите «Экспортировать набор данных», выберите тип данных и ЛЕЧЕНИЕ ГЕНОТИП. Сохраните оценки CVA в формате TXT.
Чтобы подготовить файл для PAST, откройте сохранённые оценки CVA в текстовом редакторе. Замените термин id в левом верхнем углу на Label и сохраните отредактированный файл. Откройте программу PAST и нажмите «Файл», затем откройте, чтобы выбрать отредактированный файл оценок CVA.
В окне импорта. Выберите Имена, данные для строки и столбца и Tab как разделитель, затем нажмите Импорт. Во вкладке «Показать» выберите атрибуты Column.
В выпадающем меню рядом с разделом «Тип» назначите группу первому столбцу с переменными классификаторов. Выделите главный компонент или канонические вариантные столбцы данных. Выберите Многомерный, затем Тесты, и выберите Многомерную нормальность, чтобы выполнить тест нормальности отдельно для основных компонентов и канонических вариантов.
Нажмите на серую пустую ячейку в левом верхнем углу над разделом «Тип», чтобы выбрать весь набор данных. Выберите «Многомерный», затем «Тесты» и выберите многомерный анализ вариантов для проведения анализа. Экспортировать результаты MANOVA в ранее созданный файл таблицы.
Были получены изображения висцерокрания для каждой личинки в каждой генотипе и группе лечения. Хрящи висцерокрания были помечены на репрезентативном изображении, а на каждом изображении размещались ориентиры для генерации наборов данных, отмеченных ориентирами. Главный компонент 1 составлял примерно 34% общего изменения формы, а главный компонент 2 — 20%.
Каждый главный компонент демонстрировал специфические вариации висцерокраниальной формы относительно средней формы всех висцерокраний. График основного компонентного анализа показал перекрывающиеся средние среди групп генотипа и лечения без чёткого кластерирования. Личинки дикого типа, обработанные этанолом, демонстрировали значительный эллипс 95% от среднего из-за малого размера выборки.
Канонический вариант 1 представлял собой незначительное укорочение или удлинение цератогиального соединения в пурпурном каркасе по сравнению со средним чёрным каркасом. Канонический вариант 2 показал сдвиг медиально только с одной стороны висцерокрания в суставах между Меккелс-палатоквадратом и небёчественно-цератогиальным суставом. Личинки, обработанные этанолом, демонстрировали значительный эллипс 95% от среднего, который перекрывался со всеми другими группами.
Многомерный анализ вариантов выявил значительный общий эффект генотипа и лечения. Самая большая проблема — регулярная монтаж сэмпл. Наклонённая личинка может привести к неточным измерениям и изменять результаты.
Этот протокол адаптируется к различным анатомическим структурам, анализирует 3D-данные, генерирует линейные измерения и помогает определять размеры экспериментальных выборок. Будущие исследования будут изучать и другие чувствительности к генотипам к этанолу, расширять размеры выборок и применять этот универсальный набор инструментов к различным анатомическим структурам.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative morphometric analysis of craniofacial shape in zebrafish enables high-resolution detection of subtle phenotypic effects from gene-environment interactions, such as those relevant to fetal alcohol spectrum disorders. This workflow enhances predictive confidence in early-stage target validation and supports mechanistic de-risking for developmental toxicity studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions where phenotypic screening and translational continuity are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene-environment interactions affecting craniofacial development.
- Supports functional target validation by quantifying subtle morphological phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through multivariate statistical analysis of shape variation.
- Improves predictive confidence for developmental toxicity endpoints.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream phenotypic screening workflows.
- Standardizes landmark-based morphometric assays for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation.
- Enables robust assay development for gene-environment interaction studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish craniofacial phenotypes with disease-relevant endpoints in FASD research.
- Supports translational biomarker identification through quantitative shape metrics.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of developmental toxicity.
- De-risks advancement decisions by clarifying subtle phenotypic effects.
Pipeline & Workflow Integration
This morphometric workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and phenotypic screening in zebrafish models.
- Discovery Biology: Quantifies gene-environment effects on craniofacial development for hypothesis-driven studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative shape data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides principal component, canonical variate, and MANOVA outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges zebrafish phenotypes to human-relevant developmental endpoints.
- Enterprise Reuse: Toolbox is adaptable to other anatomical structures and scalable for broader R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental toxicity studies.
- Operational Value: Standardizes morphometric analysis for reproducibility and cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene-environment interaction targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in morphometric analysis and zebrafish developmental biology.
- Needs access to imaging, landmarking, and statistical analysis software (tpsDigs2, MorphoJ, PAST).
- Demands rigorous sample mounting and orientation for reproducible results.
- Adaptable to 3D data and other anatomical structures with protocol modifications.
- Sample size and mounting consistency are critical for statistical power and accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
