Морфометрический анализ формы: инструментарий для анализа для количественного определения черепно-лицевой формы у данио-рерио.
February 27th, 2026
В данной работе описывается протокол количественной оценки формы краниофациального хряща с помощью бесплатного программного обеспечения (tpsDigs2, MorphoJ и PAST) для измерения изменений структуры лица у личинок данио-рерио.
Наши исследования используют морфометрическое программное обеспечение для количественного определения, взаимодействуют ли этанол и bmp7a, вызывая тонкие черепно-лицевые дефекты у данио-рерио. Линейные меры пропускают тонкие изменения. С помощью этого метода мы используем ориентиры для количественной оценки изменений формы, учитывая различия в размерах.
Для начала откройте программное обеспечение tpsDigs2. Нажмите Input source, затем File и выберите сохранённый файл TPS Notepad. Нажмите «Параметры», чтобы визуализировать опцию «Инструменты изображения».
Установите опорную длину на 100 микрометров и нажмите на шкале Set. Нажмите OK, чтобы подтвердить параметры масштаба, затем выйдите из окна инструментов изображения. Затем нажмите на символ прицеливания и поставьте первый ориентир на средний сустав между хрящами Меккеля.
Разместите вторые ориентиры в двусторонних суставах между хрящами Меккеля и небёцоквадровым хрящем. Разместите третий ориентир в среднем суставе между цератогиальными хрящами, а четвёртый — в двусторонних суставах между небёчноквадратным и цератогиальным хрящами. Затем разместите пятые ориентиры на дистальной стороне гиомандибулярных хрящей, чтобы ориентиры были расположены в одном порядке для каждого изображения.
После размещения ориентиров нажмите «Файл», чтобы открыть выпадающее меню. Выберите «Сохранить данные», а затем «Перезаписать», чтобы сохранить обновлённый файл. Выйдите из программы tpsDigs2.
Запустите программное обеспечение MorphoJ. Нажмите «Файл», выберите «Создать новый набор данных» и присвоите имя набору данных. Нажмите TPS и выберите файл блокнота, содержащий недавно добавленные данные.
Затем создайте набор данных. В Дереве проектов нажмите на набор данных. Выберите предварительные этапы, затем подгоняйте новые Прокрусты.
Выберите «Выровнять по главным осям» и нажмите «Выполнить подход Прокруста». В разделе Предвариальные параметры выберите Generate Covariance Matrix, чтобы получить координаты прокруста. Выполняйте функцию по запросу.
Теперь выберите Создать или Редактировать Wireframe и свяжите точки на изображениях. Кликайте по связанным точкам, принимайте или создайте изображение, затем редактируйте классификаторы по необходимости. Откройте программу с таблицами, оставив MorphoJ открытым.
Введите информацию о классификаторе, такую как GENOTYPE, TREATMENT и GENOTYPE TREATMENT, затем сохраните файл как CSV-файл. В MorphoJ нажмите File и выберите Import Classifier Variables, чтобы импортировать CSV-файл. Вернитесь в Дерево проектов и кликните по набору данных.
В разделе «Предварительные» выберите «Редактировать классификаторы», чтобы убедиться, что все изображения включены. В Дереве проектов выберите CovMatrix, затем нажмите Variation в верхней части страницы. Выберите Анализ основных компонентов для расчёта оценок основных компонентов.
Нажмите на PC scores, чтобы показать сгенерированный график. Кликните правой кнопкой мыши по графику и выберите Confidence Ellipsis, чтобы добавить нужный классификатор. Выберите точки цветовых данных, назначьте цвета и нажмите OK, чтобы применить изменения.
В разделе «Предварительные параметры» выберите «Настройки для графа форм», расположенного внизу экрана. Выберите Wireframe Graphs и измените цвета целевой формы, начальной формы и чисел. Выберите вариацию, затем выберите прокруст ANOVA.
Экспортировать результаты ANOVA procrustes в ранее созданный файл таблицы. В MorphoJ выберите исходный набор данных в Project Tree. Нажмите «Сравнение», затем «Канонический вариантный анализ».
Выберите переменную классификатора GENOTYPE TREATMENT и выполните функцию. Чтобы экспортировать результаты, нажмите на вкладку «Результаты» и кликните правой кнопкой мыши на странице результатов. Выберите «Экспортировать в файл» и сохранить результаты.
В проектном дереве выберите канонический вариантный анализ, затем оценивайте оценки. Нажмите «Файл», выберите «Экспортировать набор данных», выберите тип данных и ЛЕЧЕНИЕ ГЕНОТИП. Сохраните оценки CVA в формате TXT.
Чтобы подготовить файл для PAST, откройте сохранённые оценки CVA в текстовом редакторе. Замените термин id в левом верхнем углу на Label и сохраните отредактированный файл. Откройте программу PAST и нажмите «Файл», затем откройте, чтобы выбрать отредактированный файл оценок CVA.
В окне импорта. Выберите Имена, данные для строки и столбца и Tab как разделитель, затем нажмите Импорт. Во вкладке «Показать» выберите атрибуты Column.
В выпадающем меню рядом с разделом «Тип» назначите группу первому столбцу с переменными классификаторов. Выделите главный компонент или канонические вариантные столбцы данных. Выберите Многомерный, затем Тесты, и выберите Многомерную нормальность, чтобы выполнить тест нормальности отдельно для основных компонентов и канонических вариантов.
Нажмите на серую пустую ячейку в левом верхнем углу над разделом «Тип», чтобы выбрать весь набор данных. Выберите «Многомерный», затем «Тесты» и выберите многомерный анализ вариантов для проведения анализа. Экспортировать результаты MANOVA в ранее созданный файл таблицы.
Были получены изображения висцерокрания для каждой личинки в каждой генотипе и группе лечения. Хрящи висцерокрания были помечены на репрезентативном изображении, а на каждом изображении размещались ориентиры для генерации наборов данных, отмеченных ориентирами. Главный компонент 1 составлял примерно 34% общего изменения формы, а главный компонент 2 — 20%.
Каждый главный компонент демонстрировал специфические вариации висцерокраниальной формы относительно средней формы всех висцерокраний. График основного компонентного анализа показал перекрывающиеся средние среди групп генотипа и лечения без чёткого кластерирования. Личинки дикого типа, обработанные этанолом, демонстрировали значительный эллипс 95% от среднего из-за малого размера выборки.
Канонический вариант 1 представлял собой незначительное укорочение или удлинение цератогиального соединения в пурпурном каркасе по сравнению со средним чёрным каркасом. Канонический вариант 2 показал сдвиг медиально только с одной стороны висцерокрания в суставах между Меккелс-палатоквадратом и небёчественно-цератогиальным суставом. Личинки, обработанные этанолом, демонстрировали значительный эллипс 95% от среднего, который перекрывался со всеми другими группами.
Многомерный анализ вариантов выявил значительный общий эффект генотипа и лечения. Самая большая проблема — регулярная монтаж сэмпл. Наклонённая личинка может привести к неточным измерениям и изменять результаты.
Этот протокол адаптируется к различным анатомическим структурам, анализирует 3D-данные, генерирует линейные измерения и помогает определять размеры экспериментальных выборок. Будущие исследования будут изучать и другие чувствительности к генотипам к этанолу, расширять размеры выборок и применять этот универсальный набор инструментов к различным анатомическим структурам.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
