Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

Общая цель данной процедуры заключается в предоставлении автоматизированного метода анализа и количественной оценки изменений морфологии клеток неопределенной формы на основе трехмерных конфокальных флуоресцентных изображений. Это достигается путем проведения эксперимента по химической стимуляции, который включает клетки, обработанные агонистом, клетки, обработанные антагонистом с последующим добавлением агониста, а также необработанные клетки. Затем клетки подготавливают для иммунофлуоресцентного анализа.

Вторым этапом является получение мультиспектральных трехмерных флуоресцентных изображений. Затем с помощью программного обеспечения ameris neuroscience, ameris XT и MATLAB проводится трехмерный морфометрический анализ. В качестве заключительного этапа анализируются и количественно оцениваются фенотипические изменения отдельных клеток, визуализированные с помощью трехмерного морфометрического анализа.

В конечном счете, данная программная платформа используется для количественной оценки изменений формы клеток после активации рецепторов, предоставляя дополнительный инструмент для поиска новых лекарственных средств. Как правило, исследователи обладают стандартными знаниями в области биологических систем, но могут быть не знакомы с компьютерными приложениями. В данном протоколе в модуле I 60 перед началом процедуры устраняется разрыв между визуализацией и компьютерным языком.

Проведите трансфекцию клеток эмбриональной почки человека рецептором кортикотропин-рилизинг-фактора 2 (CRF R2) с гемагглютинин-тегом, как указано в письменном протоколе. CRF R2 представляет собой рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR). На следующий день после трансфекции обработайте покровные стекла пламенем и поместите их в шестилуночный планшет.

Добавьте 10 мл PBS в виалу с пятью миллиграммами лиофилизированного полилизина и перемешайте. Затем разведите пять миллилитров растворенного полилизина в 500 мл PBS и нанесите по два миллилитра полученной смеси на каждое покровное стекло. Оставьте планшет с покровными стеклами при комнатной температуре на 20 минут. По истечении 20 минут промойте покровные стекла, добавив два миллилитра PBS и затем удалив его; повторите эту процедуру дважды.

После добавления 2 mL среды DMEM с 10% FBS нанесите от двух до пяти капель суспензии клеток на покровные стекла. Концентрация клеток должна быть такой, чтобы обеспечить 60% конфлюэнтности. На следующий день.

Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C. На следующий день убедитесь, что конфлюэнтность клеток составляет 60% для обработки агонистом. Стимулируйте назначенные клетки, заменив среду на 2 mL среды с добавлением эндогенного лиганда CRF R2 — кортикотропин-рилизинг-фактора в концентрации 1 µM.

Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C в течение 30 минут для предварительной обработки клеток антагонистом. Замените среду на 2 mL среды, дополненной селективным антагонистом CFR two anti salvaging 30 в концентрации 1 µM. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C в течение 30 минут.

После обработки антагонистом. Стимулируйте клетки агонистом CRF и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 минут (для необработанных клеток). После обработки замените среду на 2 мл свежей среды.

Замените среду в каждой лунке на 2 mL свежей среды и добавьте анти-HHA в разведении 1:1000, после чего инкубируйте в течение 60 минут при 37 °C. Отсосируйте среду и добавьте по 2 mL фиксатора в каждую лунку. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 20 минут, затем отсосируйте фиксатор.

Промойте клетки трижды трис-солевым буферным раствором (TBSC). Добавьте по 100 µL раствора блокирующего агента на каждое покровное стекло и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аспирируйте имеющийся блокирующий раствор из лунок и добавьте по 100 µL свежего коктейля вторичных антител на каждое покровное стекло; инкубируйте 45 минут при комнатной температуре в темноте. Промойте четыре раза TBSC, осторожно добавляя и удаляя раствор со стенки лунки, оставив в итоге финальный промывочный раствор.

Аккуратно поднимите каждое покровное стекло с помощью иглы и изогнутого пинцета. Поместите покровное стекло клетками вниз на предметное стекло с каплей среды для заключения Vector Shield, зафиксируйте его бесцветным лаком для ногтей и дайте высохнуть в течение 15–20 минут. Для визуализации CFR2 используется конъюгированное мышиное антитело Alexa 488 нм, а для визуализации ядер и стадий митоза — DAPI. Для начала исследования поместите фиксированные клетки под флуоресцентный микроскоп. Чтобы ограничить субъективность эксперимента, не раскрывайте условия опыта до момента получения и анализа изображений. Для получения снимков выполните следующее.

Планарный ахроматический масляный объектив с 63-кратным увеличением и числовой апертурой 1.4 использовался в сочетании с конфокальным микроскопом Zeiss LSM 510 Meta, подключенным к интегрированной двухфотонной лазерной системе Coherent. В процессе сбора данных клетки разделяли на компартменты с помощью многоканального и C-партиционирования, чтобы охватить данные от ядерной мембраны до внешних окончаний внеклеточных рецепторов. Флуоресцентные данные обрабатывали с помощью программы Amaris, которая позволяет визуализировать и сегментировать трехмерные наборы данных микроскопии. Согласно алгоритму, разработанному в Amaris, сначала использовали метод отрисовки поверхности (surface rendering) для представления ядерной мембраны.

Программа Amaris определит, имеется ли в области интереса (ROI) более одного ядра. Затем с помощью алгоритма создания точек (spots creation algorithm) будут определены два участка расширения CFR two. Для компенсации фонового шума и неравномерной интенсивности сложной сети аморфных клеток и обеспечения максимального охвата каждой единицы флуоресцентного детектирования CFR two установите диаметр точек 0.2 micrometers, что является минимальной единицей в данном изображении.

Это позволяет экстраполировать определенную информацию в виде измеренной интенсивности. С помощью фильтра Гаусса внедрите фильтрацию пятен в процесс их автоматического создания. Чтобы избежать искажения данных, преобразуйте набор данных из восьмибитного формата с фиксированной запятой в 32-битный формат с плавающей запятой.

Выберите созданную поверхность и определите точное пространственное положение каждого пятна за пределами поверхности ядра, выполнив преобразование расстояний с использованием ядерной мембраны в качестве опорной точки. Преобразуйте данные об интенсивности вокселей в координаты пятен с помощью модуля ameris XT, сопряженного с MATLAB. Выберите пятна и укажите статистический код в поле типа статистики.

Выберите центр интенсивности, указанный в созданном новом канале. Загрузите нужный цвет для отображения и установите диапазон цветовой карты для анализа. Численные данные можно визуализировать во вкладке статистики и экспортировать в Excel с помощью GraphPad Prism.

Количественно оцените полученные данные и представьте их в графическом формате для статистического анализа. Проведите сравнение между группами с использованием двухфакторного ANOVA и апостериорного теста Бонферрони; представьте данные в виде среднего значения плюс или минус стандартное отклонение. Чтобы продемонстрировать эффективность данного подхода, исследуйте клеточные изменения, возникающие в результате взаимодействия рецепторов, сопряженных с G-белком, и рецептора кортикотропин-рилизинг-фактора 2 с его эндогенным лигандом CRF.

В трансфицированных клетках HT K 2 93 было проведено количественное определение; совмещенные изображения визуализировали с помощью вторичных антител против мыши, конъюгированных с Alexa 4 88, и DPI для визуализации ядер. Результаты показывают, что рецепторы CRF R два локализованы в плазматической мембране и выступают из ограниченных областей мембраны клеток. При использовании стандартного 2D-анализа обнаружить эту подгруппу внеклеточных рецепторов CRF R два можно только в том случае, если анализируются точки адгезии рецепторов на стеклянных покровных стеклах.

Следовательно, любая другая информация, полученная из наложенных друг на друга МУЛЬТИСПЕКТРАЛЬНЫХ данных ZS, теряется. В результате не было выявлено никакой разницы между отсутствием обработки и воздействием агониста. В то время как точки адгезии рецепторов значительно различаются при обработке клеток CRF, количество внеклеточных рецепторов существенно снижается, о чем свидетельствует уменьшение расстояния от пятен до плазматической мембраны.

Они также перераспределяются из преимущественно ограниченных зон в ряд дискретных локаций. Эффект CRF на распределение рецепторов в мембране предотвращается предварительной обработкой специфическими антагонистами CR2. 30 30.

В этих условиях два расширения CRFR не изменяются при воздействии CRF. Для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны используется дистальное распределение пятен, построенное с интервалами пяти микрометров с цветовой кодировкой спектра. Отсутствие лечения и предварительное введение антагониста перед введением агониста не показали значимых различий в сокращении GPCR.

Обработка клеток агонистом CRF приводит к прогрессивному снижению количества вокселей, содержащих CFR two, по сравнению с отсутствием обработки или с клетками, предварительно обработанными антагонистом As после его разработки. Данный метод открыл исследователям в области количественных методов визуализации путь к изучению и характеристике многочисленных фенотипических изменений в единичных клетках, что делает этот клеточный анализ дополнительным инструментом профилирования единичных клеток для процесса разработки лекарственных препаратов.