Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы предоставить автоматизированный метод для анализа и количественной оценки изменений в морфологии клетки неопределенной формы, взятых из трехмерных конфокальных флуоресцентных изображений. Это достигается путем предварительного проведения эксперимента по химической стимуляции с включением клеток, обработанных агонистами, обработанных антагонистом, затем агонистов и клеток, не подвергающихся лечению. Затем клетки подготавливают к иммунофлуоресцентному анализу.

Вторым шагом является получение мультиспектральных трехмерных флуоресцентных изображений. Далее проводится трехмерный морфометрический анализ с использованием ameris neuroscience, ameris XT и компьютерного программного обеспечения MATLAB. Фенотипические изменения отдельных клеток, визуализированные с помощью трехмерного морфометрического анализа, затем анализируются и количественно оцениваются в качестве заключительного этапа.

В конечном счете, эта программная платформа используется для количественной оценки изменений в форме клеток после активации рецепторов, предоставляя дополнительный инструмент для разработки лекарств. Как правило, исследователь обладает стандартными знаниями в области биологических систем, может не иметь представления о компьютерных приложениях. В этом протоколе в модуле I 60 преодоление разрыва между визуализацией и компьютерным языком До начала этой процедуры.

Трансфектируйте эмбриональные клетки почек человека гемагглютинином, помеченным вторым рецептором кортикотропин-рилизинг-фактора или CRF R два, как указано в письменном протоколе. CFR two — это рецептор, сопряженный с G-белком, или GPCR. На следующий день после трансфекции пламя накидывают и помещают их в шестилуночную пластину.

Добавьте 10 миллилитров PBS во флакон с пятью миллиграммами лиофилизированного полилизина и перемешайте. Затем разведите пять миллилитров растворенного полилизина в 500 миллилитрах PBS и добавьте по два миллилитра смеси на каждую из покровных листов. Оставьте пластину с покровными листами при комнатной температуре на 20 минут Через 20 минут промойте покровные листы, добавив два миллилитра PBS и затем сняв, повторите этот процесс дважды.

После дозирования двух миллилитров DMEM с 10% FBS средой добавьте от двух до пяти капель клеток на покровные листы. Клетки должны быть в концентрации, необходимой для достижения 60% плавности. На следующий день.

Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день. Убедитесь, что клетки на 60% слиты друг с другом для лечения агонистами. Стимулируйте указанные клетки путем замены среды двумя миллилитрами среды, дополненной CRF R двумя эндогенными лигандами кортикотропин-рилизинг-фактора в концентрации одного микромоля.

Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы клетки были предварительно обработаны антагонистом. Замените среду двумя миллилитрами среды, дополненной селективным CFR двумя антагонистами антиспасителя 30 в концентрации одного микромоля. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

После лечения антагонистами. Стимулируйте клетки агонистом CRF и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут для необработанных клеток. После обработки замените среду двумя миллилитрами свежей среды.

Замените среду в каждой лунке двумя миллилитрами свежей среды и добавьте анти-HHA в соотношении один к тысяче, после 60-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. Аспирируйте среду и добавьте в каждую по два миллилитра фиксатора. Хорошо инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 20 минут после отсасывания фиксатора.

Промойте ячейки трижды соевым раствором. Каин. Добавьте сверху на каждую крышку по 100 микролитров кровяного раствора, смешайте и выдерживайте комнатную температуру в течение 30 минут. Затем отсадите существующий раствор блотто из лунок и добавьте 100 микролитров свежего коктейля вторичных антител на каждую защитную салфетку после 45-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте, четыре раза промойте TBSC, осторожно добавив и удалив раствор с боковой стенки лунки, все еще находясь в окончательном растворе для промывки.

Подхватите каждый покровный листок иглой и изогнутыми щипцами. Поместите ячейки защитного стекла вниз на предметное стекло с каплей монтажного средства векторного щита с тканевым фиксатором с лаком для ногтей и дайте ему высохнуть в течение 15-20 минут. Alexa, 4 88 нанометровое конъюгированное антитело muse используется для визуализации CFR два, а DAPI используется для визуализации митотической стадии ядер, чтобы начать монтировать фиксированные клетки на флуоресцентный микроскоп, чтобы ограничить экспериментальную субъективность, сохранить экспериментальные условия неизвестными до тех пор, пока изображения не будут получены и проанализированы для получения изображений.

В процессе сбора данных разделите клетки как по многоканальному, так и с помощью разделения c, чтобы включить данные от ядерной мембраны до внешних концов внеклеточных рецепторов. Обрабатывайте флуоресцентные данные с помощью amris, который позволяет визуализировать и сегментировать набор данных 3D-микроскопии. Следуя алгоритму, разработанному Амарисом, сначала используйте рендеринг поверхности для представления ядерной мембраны НУ.

Amaris определит, есть ли более одного ядра в интересующей вас области, или ROI. Затем используйте алгоритм создания точек, чтобы найти две точки расширения CFR. Компенсирует фоновый шум и неравномерную интенсивность сложной сети клеток аморфной формы для максимального включения каждой единицы флуоресценции в детекцию CFR два, устанавливает диаметр пятен 0,2 микрометра, что является наименьшей единицей в пределах изображения.

Это позволяет экстраполировать отдельную информацию в виде измеренной интенсивности. Используя фильтр Гаусса, включите фильтрацию пятен в автоматизированный процесс создания пятна. Чтобы избежать наложения данных, преобразуйте набор данных из восьмибитного с фиксированной запятой в 32-битный с плавающей запятой.

Выберите созданную поверхность и определите точное пространственное положение каждой точки за пределами ядерной поверхности, выполнив преобразование расстояний с использованием ядерной мембраны в качестве точки отсчета. Обменивайтесь данными об интенсивностях вокселей с данными о координатах точки с помощью модуля ameris XT, сопряженного с MATLAB. Выделите пятна и выберите статистические, закодированные в статистическом типе.

Выберите центр интенсивности, отображаемый в новом созданном канале. Загрузите нужный цвет для отображения и установите диапазон цветовой карты для анализа. Числовые данные можно визуализировать на вкладке статистики и экспортировать в Excel с помощью призмы GraphPad.

Количественно оцените полученные данные и представьте их в графическом формате для статистического анализа. Проводите сравнения между группами с использованием двухфакторных данных Inova и Bonferroni после теста в виде среднего значения плюс-минус стандартного отклонения. Чтобы продемонстрировать силу этого подхода, можно рассмотреть клеточные изменения, которые происходят в результате взаимодействия рецепторов, сопряженных с G-белком, и рецептора второго кортикотропин-рилизинг-фактора с его эндогенным лигандом CRF.

В трансфицированных клетках HT K 2 93 количественно визуализировали объединенные изображения с использованием конъюгированного Alexa 4 88, антимышиного антитела, вторичного антитела и DPI для визуализации ядер. Результаты показывают, что два рецептора CRF R расположены в плазматической мембране и проецируются из конечных областей мембраны клеток. Используя обычный 2D-анализ, можно обнаружить это подмножество двух рецепторов внеклеточной CRF R только в том случае, если проанализировать точки адгезии рецепторов на стеклянных крышках.

Следовательно, любая другая информация, полученная из данных ZS stacked MULTISPECTRAL, теряется. В результате не было никакой разницы между отсутствием лечения и агонистом. В то время как точки адгезии рецепторов резко различаются при обработке клеток CRF, внеклеточные рецепторы значительно редуцируются, о чем свидетельствует уменьшение расстояния между пятнами и плазматической мембраной.

Они также перераспределяются из преимущественно конечных местоположений в ряд дискретных местоположений. Влияние CRF на распределение мембраны рецептора предотвращается предварительной обработкой двумя специфическими антагонистами CR. 30 30.

В этих условиях два расширения CRFR не изменяются при лечении CRF. Дистальное распределение пятен, построенное в пятимикрометровых интервалах спектра с цветовой кодировкой, используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Отсутствие лечения и предварительная обработка антагонистами перед лечением агонистами не показали существенной разницы в сокращении GPCR.

Обработка клеток агонистом CRF постепенно уменьшает количество CFR-двухсодержащих вокселей по сравнению с отсутствием лечения или по сравнению с клетками. Предварительно обработан антагонистом Ас после его разработки. Этот метод помог исследователям в области количественной визуализации исследовать и охарактеризовать многочисленные фенотипические изменения отдельных клеток, что сделало этот анализ на основе клеток дополнительным инструментом профилирования отдельных клеток для процесса разработки лекарств.