Summary
Använda högfrekvent elektrisk stimulering, beslag-liknande aktivitet kan induceras i
Abstract
Drosophila melanogaster är ett användbart verktyg för att studera beslag liknande aktivitet. En mängd olika mutanter där anfall kan framkallas antingen genom stötar eller elektrisk stimulering är tillgänglig för studier av olika aspekter av krampanfall och beteende. Alla flugor, inklusive vilda-typ, kommer att genomgå beslag-liknande aktivitet om stimuleras på en tillräckligt hög spänning. Beslag liknande aktivitet är en allt-eller-inget svar och varje genotyp har en specifik kramptröskeln. Kramptröskeln av en specifik genotyp av fluga kan ändras antingen genom behandling med ett läkemedel eller av genetiska undertryckande eller tillbehör. Tröskeln är lätt att mäta med elektrofysiologi. Beslag-liknande aktivitet kan induceras via högfrekvent elektrisk stimulering levereras direkt till hjärnan och spelas in via rygg längsgående musklerna (DLMS) i bröstkorgen. Den DLMS är innerveras av en del av den gigantiska fiber systemet. Från och med låg spänning, hög frekvens stimulans, och därefter höja spänningen i små steg, kan kramptröskeln för en enda fluga mätas.
Protocol
Provberedning:
Kvällen innan experimentet, man flyger av den önskade genotyp bedövas och placeras i en flaska med en mjuk nylon plugg. En bomullstuss skulle också fungera. Efter anesthetization är kramptröskeln ändras, så att flugorna bästa finns kvar i minst 6 timmar, men över natten är idealiskt.
På dagen för experimentet, är de flyger monteras en i taget för att glasskivor med ett lager av dentalvax på ena sidan.
En enda fluga är plockas upp av huvudet med en 23 gauge nål (med vass spets avskurna) ansluten till ett vakuum linje.
Flugan är sedan fäst på vax på bilden genom att trycka på benen och vingarna i vax.
När flugan är immobiliserade, det är vax pressas upp runt halsen och ögonen att helt immobilisera huvudet.
Elektrofysiologi:
Flugan, som nu är monterad och redo att gå placeras i elektrofysiologi inrättas.
Den elektrofysiologi Setet består av tre uppsättningar av micromanipulators, var och med en till två vässade volfram bifogade elektroder. Spänning tillhandahålls av en stimulator som är ansluten till en isolerad enhet ansluten till den stimulerande elektroder. Inspelningen elektroden är ansluten till en förförstärkare som i sin tur är ansluten till en digital lagring oscilloskop. Även om det inte är nödvändigt, det är bra att ha en högtalare kopplad till oscilloskopet så att svar kan göras hörbara.
En jordelektrod sätts in i buken på flugan.
Inspelningen elektrod förs in i en av ryggfenan Longitudinal muskler i bröstkorgen av flugan.
Den stimulerande elektroder förs in i huvudet. En till sidan av varje öga.
Stimulatorn bör ha följande inställningar för att börja: Kontinuerlig puls intervall med 2 sekunder mellan varje puls. Det bör inte finnas ingen puls dröjsmål. Pulsbredden bör 0.2ms.
Oscilloskopet ska ha lagring funktionen påslagen och har följande inställningar: Tid / DIV ska vara inställd på 1ms/DIV. Den Volt / DIV bör sättas på antingen 0.1V/DIV eller 50 mV / DIV.
Jätten fiber tröskelvärdet bestäms genom att leverera enstaka pulser och noterar den minsta spänning som krävs för att få ett svar. Denna spänning är normalt ca 2 V.
När jätten fiber tröskeln har fastställts, stoppa pulserande flugan och ändra inställningarna på oscilloskopet till: 0,2 S / DIV
Inställningarna på stimulatorn bör ändras till: Pulsen intervall ska vara inställd på singel. Tåget ska vara påslagen och inställd på 3 sekunder. Vågformen parametrar är: 0,5 ms pulser på 200 Hz till 300 ms. Spänningen ändras till önskad inställning och en hög frekvens av pulser levereras till flugans hjärna.
Om ett anfall inte framkallas, kommer oscilloskopet spår visar en rak linje efter tåget. Om inställningarna snabbt ställa tillbaka till utgångsläget inställningarna kommer den gemensamma pulser orsaka en reaktion i den gigantiska fiber systemet.
Om ett beslag är inducerad, kommer oscilloskopet visar beslag-liknande aktivitet efter tåget. Om inställningarna snabbt bytte tillbaka till de ursprungliga inställningarna, kommer den gemensamma pulser misslyckas med att aktivera ett svar i den gigantiska fiber systemet.
Flugorna har en refraktär period efter en högfrekvent stimulans wavetrain där anfall som verksamhet inte kan framkallas. Om inget anfall inträffar flugor är eldfasta i ca 7 minuter. Om ett beslag är inducerad, flugorna har en refraktär period på ungefär 17 minuter.
Vid fastställande av tröskeln, kan ytterligare högfrekvent stimuli ska levereras till samma flyga (efter lämplig tid för refraktärperioden) tills tröskeln avgörs eller tills den gigantiska fibern svaret blir för svag för att se.
Efter experimentet är klar flugan bort från elektrofysiologi upprättas, frisätts från vax, och bortskaffas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video har visat de grundläggande stegen för att bestämma kramptröskeln en enskild Drosophila flyga. Istället för att använda den digitala oscilloskop, kan ett datoriserat digitizer också användas. Denna teknik är användbar för att bedöma effekterna av en drog eller genetisk förändring på kramptröskeln av en fluga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en NIH forskningsanslag, ett Epilepsi Foundation och en McKnight Foundation till MT Försök på Drosophila bananflugor har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av UC Berkeley Animal Använd kommittén.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
