Summary
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.
Abstract
Protoplasten sind Pflanzenzellen, die hatten ihre Zellwände enzymatisch entfernt haben. Isolation von Protoplasten aus verschiedenen pflanzlichen Geweben wurde erstmals berichtet, mehr als 40 Jahren
Protocol
Teil 1. Vorbereitung der festen Medium für den Anbau von Pflanzen.
Wir typischerweise Kultur Pflanzen konzentriert Murasige und Skoog (MS)-Medium mit 1% Saccharose und 0,7% Agar. Es enthält alle notwendigen Zutaten, um die Pflanzen gesund.
Für die Herstellung von 1L MS-, Medien-pH-Wert 5,7
- Add 2,15 g MS-Pulver in 800 ml Wasser in 1,5-2.0L autoklavierbar Flasche.
- Legen Sie einen Rührstab in die Flasche und lösen MS Pulver durch Rühren Medium auf eine mitreißende Platte.
- Unter Rühren hinzufügen, Tropfen für Tropfen, bis 1N KOH pH-Wert von MS-Medium auf 5,7 einstellen.
- Fügen Sie 10 g Saccharose, immer schön rühren.
- Add 7 g Agar *.
- Passen Sie das endgültige Volumen der vorbereiteten mittel-bis 1000 ml und durch Autoklavieren sterilisieren .*
- Legen Sie autoklavierten Medium auf eine mitreißende Platte und cool it down Rühren, so dass Agar nicht Niederschlag am Boden der Flasche. Cool down mittel-bis ~ 60 ° C *
- Gießen Sie 100 mm Petrischalen. Keep Platten bei 4 ° C.
* Tipp 1: Versuchen Sie nicht, Agar aufzulösen. Es wird beim Autoklavieren zu lösen.
* Tipp 2: Halten Sie das Rühren bar in eine Flasche beim Autoklavieren, du wirst es später brauchen.
* Tipp 3: Wenn Sie Sie die Hände auf dem autoklavierten Flasche für 10 s halten kann, bedeutet dies, dass das Medium ausreichend abgekühlt hat, und Sie können beginnen Gießen Platten.
Part 2. Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen.
- Sterilisieren Samen von Arabidopsis thaliana
- Platz 100 mg Samen in Eppendorf Reaktionsgefäße und 1 ml 70% Ethanol. Gut mischen und inkubieren für 2 min. Spin Körnern, saugen Sie den Überstand.
- 1 ml 1,8% Bleichmittel-Lösung * mit 0,1% Tween-20. Mix für 10 min. Spin down Samen und saugen Bleichlösung.
- Dieser Schritt muss in einer Sterilbank durchgeführt werden. 1 ml sterilem Wasser, Samen, gut mischen. Spin down Samen, saugen Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 mal.
- Spread-Samen auf den vorbereiteten in Schritt 1 Platten (100 Korn / Platte).
- Halten gesetzten Platten für 24-48 h bei 4 ° C im Dunkeln für die Stratifizierung.
- Wachsen Pflanzen für 14 Tage in der Klimakammer mit 8 h light/16 h dunkel Photoperiode (bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 250 mmol m -2 s -1) bei 23 / 19 ° C hell / dunkel Temperatur-Regime und 75% relative Feuchte.
* Tipp 1: Bleach-Lösung wird-up durch Verdünnung eines Haushalts Clorox, mit 6% Natriumhypochlorit und Zugabe von Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,1%.
Teil 3. Isolation von Protoplasten aus Arabidopsis-Keimlinge.
- Scheiben von 2 g 14-Tage alte Keimlinge mit einer frischen Rasierklinge in 15 ml Filter-sterilisiert TVL Solution. Wir hacken Pflanzenmaterial in sterile Einweg-Petrischalen.
- Transfer gehackte Gewebe in 200 ml Becherglas mit 20 ml Filter-sterilisiert Enzymlösung, wirbeln den Becher zu lassen Gewebe mischen sich mit Enzymlösung, mit Parafilm und Alufolie abdecken.
- Schütteln Sie Pflanzengewebe bei 35 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln bei Raumtemperatur für 16-18 h.
- Sammeln Sie die Freigabe Protoplasten in 50 ml Falcon-Röhrchen durch Sieben bis 8 Schichten der Gaze, pre-Nass-in W5-Lösung.
- Sieve Protoplasten aus der Käse-Tuch noch einmal durch Waschen Sie das Tuch mit 15 ml W5-Lösung.
- Sorgfältig Overlay Protoplasten mit 10 ml W5-Lösung, stören die Zucker-Gradienten; Zentrifuge für 7 min bei 100 g.
- Sammeln Sie 10 ml des Protoplasten an der Schnittstelle von Enzymlösung und W5-Lösung (Abb. 1B) und an einem neuen 50 ml Falcon-Röhrchen.
- 15 ml W5-Lösung, Zentrifuge für 5 min bei 60 g. Entfernen Sie den Überstand.
- Wash Protoplasten frei von Enzymlösung durch Resuspendieren Protoplasten in 15 ml W5-Lösung, Zentrifuge 5 min bei 60 g
- Entfernen Sie den Überstand resuspendieren pelletiert Protoplasten in 1-3ml W5-Lösung.
- Bewerten Protoplasten Ausbeute durch Zellzählung mit einer Zählkammer.
Teil 4. Reagenzien:
TVL: 0,3 M Sorbit, 50 mM CaCl 2 Filter-sterilisiert und bei -20 ° C.
Enzymlösung: 0,5 M Saccharose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filter-sterilisiert und frisch verwenden.
W5-Lösung: 0,1% (w / v) Glucose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filter-sterilisiert und bei Raumtemperatur lagern.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:
Mit Arabidopsis Kulturbedingungen in den Teilen 1 und 2 beschrieben macht gesunde Setzlinge, geeignet für die Isolierung von Protoplasten (Abb. 1A). Protoplasten werden durch Saccharose Dichtegradient gereinigtHNO-Zentrifugation gesammelt und an der Schnittstelle von W5 und Enzym-Lösungen (Abb. 1B). Mit Protoplastenisolierung Verfahren in Teil 3 beschrieben wir in der Regel Ernte 05 bis 10 Oktober 6 von intakten Protoplasten (Abb. 1C) von einem Gramm frische Keimlinge.
Abbildung 1. Isolation von Protoplasten aus Arabidopsis-Keimlinge. A, Gewebe aus 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis gesammelt wurden, und konvertierte zum Protoplasten durch ein modifiziertes Verfahren (Chen und Halkier, 2000). B, wurden Protoplasten durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und gesammelt an der Schnittstelle von Enzymlösung und W5 Uffer (weiße Pfeile). C, Hellfeld-Mikroskopie von Protoplasten. Mikrophotographien wurden mit Hilfe einer gekühlten CCD-Kamera eine Schnittstelle mit dem Zeiss Axioskop 2 plus Mikroskop.
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Discussion
Um die hohe Ausbeute an intakten Protoplasten ist es sehr wichtig, um Start-up mit gesunden Pflanzen. Verwenden Sie Filter-sterilisiert Lösungen für die Isolierung von Protoplasten. Beachten Sie, dass Protoplasten zerbrechlich sind. Deshalb, wenn Sie Handling Protoplasten, nicht zu verwechseln, Pipette oder Wirbel zu heftig, da es bremst sie. Stattdessen mischen Protoplasten durch langsam drehende oder Abkleben der Zentrifugenröhrchen. Die beschriebene Vorgehensweise ergeben intakte Protoplasten, die lebensfähig sind für mindestens 96 h. Daher kann Protoplasten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie subzelluläre Lokalisierung von Proteinen, die Isolierung und Analyse von intakten Organellen und gezielte Gen-Inaktivierung durch doppelsträngige RNA-Interferenz (RNAi), etc 3-5 studieren.
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Disclosures
Die vorläufige Patentanmeldung beschreibt dieses Verfahren für den Einsatz in funktionellen Analysen von Pflanzen-Genen wurden mit Cornell Center For Technology Enterprise und Vermarktung (CCTEC), Juni 2008 eingereicht worden. Docket No 50341/015001: Vatamaniuk, OK, und Zhai, Z. Methode zur schnellen funktionellen Analysen von Pflanzen-Genen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant und Cornell unterstützt Start-Up zum OKV gewährten Zuschusses
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
