Summary
Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.
Abstract
Los protoplastos son células vegetales que han tenido sus paredes celulares enzimáticamente eliminado. El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de plantas se registró por primera vez hace más de 40 años
Protocol
Parte 1. Preparación de un medio sólido para el cultivo de plantas.
Por lo general las plantas de la cultura en el concentrado Murasige y Skoog (MS) suplementado con 1% de sacarosa y 0,7% de agar. Contiene todos los ingredientes necesarios para mantener las plantas sanas.
Para preparar 1 litro de MS, el pH 5,7
- Añadir 2,15 g de MS polvo en 800 ml de agua en botella de 2,0 litros de 1,5 autoclavable.
- Coloque una barra de agitación en la botella y disuelva el polvo MS agitando medio de una placa de agitación.
- Mientras se agita, añadir gota a gota, KOH 1N para ajustar el pH del medio MS con 5,7.
- Agregar 10 g de sacarosa, seguir revolviendo.
- Añadir 7 g de agar *.
- Ajustar el volumen final del medio preparado a 1000 ml y esterilizar en autoclave .*
- Coloque el autoclave medio en una placa de agitación y enfriarlo mientras se agita, por lo que el agar no se precipitará en la parte inferior de la botella. Enfriamiento a medio y 60 º C. *
- Vierta 100 mm placas de Petri. Mantenga las placas a 4 ° C.
* Tip 1: No intente disolver el agar. Se solubilizan en autoclave.
* Tip 2: Mantenga la barra de agitación en una botella durante el tratamiento en autoclave, ya que lo necesitará más adelante.
* Consejo 3: Si usted puede mantener las manos en el frasco en un autoclave durante 10 s, significa que el medio se ha enfriado lo suficiente y se puede empezar a verter las placas.
Parte 2. Material vegetal y condiciones de crecimiento.
- Esterilizar las semillas de Arabidopsis thaliana
- Colocar 100 mg de semillas en tubos de microcentrífuga eppendorf y agregar 1 ml de etanol al 70%. Mezclar bien e incubar durante 2 min. Girar las semillas hacia abajo, aspirar el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de solución de lejía al 1,8% * que contiene 0,1% de Tween-20. Mezcla durante 10 minutos. Decantar semillas y solución de cloro aspirado.
- Este paso tiene que ser hecho en una campana de flujo laminar. Añadir 1 ml de agua estéril a las semillas, mezclar bien. De girar las semillas, se aspira el agua. Repita este paso 5 veces.
- Difundir las semillas en el preparado en el paso 1 placas (100 semillas / placa).
- Mantenga placas sembradas durante 24-48 horas a 4 ° C en la oscuridad de la estratificación.
- Crecer las plantas durante 14 días en la cámara de crecimiento de 8 h luz/16 h oscuridad fotoperíodo (con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 250 mmol m -2 s -1) a 23 / 19 ° C de luz / oscuridad régimen de temperatura y 75% en relación humedad.
* Tip 1: solución de cloro se hace-por dilución de un hogar de Clorox, que contiene 6% de hipoclorito de sodio y la adición de Tween-20 a una concentración final de 0,1%.
Parte 3. El aislamiento de protoplastos a partir de plántulas de Arabidopsis.
- El segmento 2 g de 14 días de edad, las plántulas con una cuchilla de afeitar nueva en 15 ml de solución esterilizada por filtración, líneas de TV. Cortamos el material vegetal en estériles desechables platos de Petri.
- La transferencia de los tejidos cortados en el vaso de 200 ml, 20 ml de solución enzimática esterilizada por filtración, se agita el vaso para que mezcla tejidos con la solución de la enzima, se cubre con parafina y papel de aluminio.
- Agite tejidos de las plantas a 35 rpm en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16-18 h.
- Recoge los protoplastos liberados en 50 ml tubo Falcon por tamizado a través de ocho capas de la tela de queso, pre-húmedo en la solución W5.
- Tamiz protoplastos a partir de la gasa una vez más por el lavado de la tela con 15 ml de solución W5.
- Cuidadosamente protoplastos superposición con 10 ml de solución W5, no molestar el gradiente de azúcar; centrifugar durante siete minutos a 100 g.
- Recoger 10 ml de protoplastos en la interfaz de la solución enzimática y W5 solución (Fig. 1B) y traslado a un nuevo tubo Falcon de 50 ml.
- Agregar 15 ml de solución W5, centrifugar durante 5 min a 60 g. Eliminar el sobrenadante.
- Lavado de protoplastos libre de solución de la enzima por resuspensión protoplastos en 15 ml de solución W5, centrifugar durante 5 minutos a 60 g
- Retire los protoplastos sobrenadante, resuspender en pellets 1-3ml de solución W5.
- Evaluar el rendimiento de protoplastos por conteo de células con un hemocitómetro.
Parte 4. Reactivos:
TVL: 0,3 M sorbitol, 50 mM de CaCl2 Filtro-esterilizar y almacenar a -20 ° C.
Solución de la enzima: 0,5 M de sacarosa, 10 mM MES-KOH [pH 5.7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, 1% de celulasa (Onozuka R-10), el 1% Macerozyme (R10). Filtro de esterilización y el uso de recién.
W5 Solución: 0,1% (w / v) de glucosa, 0,08% (w / v) de KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filtro-esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.
Parte 5: Resultados del representante:
Uso de las condiciones descritas en Arabidopsis cultura partes 1 y 2 hace plántulas sanas, adecuadas para el aislamiento de protoplastos (Fig. 1A). Protoplastos son purificados por gradientes de densidad de sacarosadiferentes centrifugación y se recoge en la interfaz de W5 y soluciones enzimáticas (Fig. 1B). El uso del procedimiento de protoplastos aislamiento descritas en la Parte 3 que por lo general la cosecha 5 al 10 octubre 6 de protoplastos intactos (Fig. 1C) de un gramo de plantas frescas.
Figura 1. El aislamiento de protoplastos a partir de plántulas de Arabidopsis. A, los tejidos de 14 días de plántulas de Arabidopsis se recogieron y se convierte en protoplastos mediante un procedimiento modificado de (Chen y Halkier, 2000). B, protoplastos fueron purificados por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y se recoge en la interfaz de la solución enzimática y W5 uffer (flechas blancas). C, el microscopio de campo brillante de protoplastos. Microfotografías fueron obtenidos mediante una cámara CCD enfriado interfaz con el Axioscope Zeiss 2 más microscopio.
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Discussion
Para asegurar el alto rendimiento de protoplastos intactos, es muy importante para la puesta en marcha de las plantas sanas. Use un filtro a esterilizar soluciones para el aislamiento de protoplastos. Recuerde que los protoplastos son frágiles. Por lo tanto, cuando usted está manejando protoplastos, no se mezclan, pipeta o vortex vigorosamente ya que les freno. En cambio, la mezcla protoplastos girando lentamente o grabar el tubo de centrífuga. El procedimiento descrito protoplastos intactos rendimiento que son viables para al menos 96 h. Por lo tanto, los protoplastos se puede utilizar para estudiar una variedad de procesos celulares, tales como la localización subcelular de las proteínas, el aislamiento y análisis de los orgánulos intactos y de genes diana de la inactivación por ARN de doble cadena de interferencia (RNAi), etc 3-5.
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Disclosures
La patente provisional que describe el procedimiento para su uso en el análisis funcional de genes de plantas han sido presentados ante Cornell Centro para la Empresa de Tecnología y Comercialización (CCTEC), junio de 2008. Expediente n º 50341/015001: Vatamaniuk, en Aceptar y, Zhai, Z. Método rápido para análisis funcional de los genes de la planta.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Estación Experimental Agrícola de la Universidad de Cornell (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant y Cornell subvención inicial concedida a OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
