Aquí se describe un protocolo básico para el marcaje fluorescente de diferentes elementos de los tubos de corazón de la larva y el adulto Drosophila melanogaster. Estas muestras son adecuadas para las imágenes a través de microscopía de fluorescencia confocal o. Esta técnica permite el análisis estructural detallado de las características de los corazones de un organismo modelo de gran alcance.
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Artículo de método
Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón
En este artículo
Resumen
Protocolo
Antes de empezar
- Prepare las siguientes soluciones:
- buffer relajante (artificial hemolinfa Drosophila (ADH) (véase "Visualización de los latidos del corazón en Drosophila") que contiene 10 mM EGTA)
- fijador (formaldehído al 4% en PBS 1x)
- PBSTx (PBS con 0,1% Triton-X-100)
- Convenientemente diluida primaria y especies específicas de la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos en PBSTx
- Diseccionar Drosophila para exponer los tubos cardíacos (de moscas adultas y / o larvas), tras
- la semi-intacta corazón Drosophi....
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Discusión
Aquí se presenta un protocolo útil para la preparación y la tinción de la embarcación Drosophila melanogaster dorsal y los tejidos a través de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal o. Ofrecemos un relato conciso de los pasos y refinado por empleado comúnmente en nuestro laboratorio para la tinción de efectivo que permita bien resueltos en las imágenes in situ de las larvas y adultos tubos corazón Drosophila. Otros han descrito métodos similares en forma abreviada 2, 3.......
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Agradecimientos
Los autores agradecen SI Bernstein (San Diego State University) para la lectura crítica y sugerencias relativas a la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH para SI Bernstein, SDSU, y R. Bodmer, BIMR, y por una beca post-doctoral de la Filial Oeste de los Estados de la Asociación Americana del Corazón para G. Vogler y A. Cammarato.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) | Reactivo | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehído, 10%, libre de metanol, ultrapuro | Reactivo | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton X-100 | Reactivo | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 faloídicina | Reactivo | Invitrogen | A12381 | |
| Medio de montaje Vectashield® para fluorescencia con DAPI | Reactivo | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Alfileres de tungsteno | Reactivo | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Portaalfileres | Reactivo | Fine Science Tools | 26018-17 |
Referencias
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
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Reimpresiones y permisos
