Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang popularisieren Et al. Für den Nachweis von durchschnittlich 4 ng Protein in Gelen. Die Färbung ist innerhalb von 2 Stunden und ohne jegliche Anstrengung abgeschlossen. Wir verwenden routinemäßig Kang-Protokoll für analytische Zwecke in Gel-Basis Proteomik.
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Methodenartikel
Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine in Polyacrylamidgelen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Coomassie Brilliant Blue (CBB) ist ein Farbstoff der Regel für die Visualisierung von Proteinen durch SDS-PAGE getrennt verwendet, bietet eine einfache Färbung und hohe Quantifizierung. Darüber hinaus ist es vollständig kompatibel mit massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen. Doch trotz dieser Vorteile ist CBB angesehen werden weniger empfindlich als Silber-oder Fluoreszenz-Färbungen und daher nur selten zum Nachweis von Proteinen in der analytischen Gel-Basis Proteomik Ansätze verwendet.
Mehrere Verbesserungen der ursprünglichen Coomassie-Protokoll 1 wurden unternommen, um die Empfindlichkeit der CBB zu erhöhen. Zwei wichtige Änderungen eingeführt wurden, um den Nachweis von low-reiche Proteine, die durch Umwandlung der Farbstoffmoleküle in kolloidalen Teilchen zu verbessern: Im Jahr 1988 angewendet Neuhoff und Kollegen 20% Methanol und höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat in die CBB G-250 basiert Färbelösung 2, und im Jahr 2004 Candiano et al. etablierten Blue Silver mit CBB G-250 mit Phosphorsäure in Gegenwart von Ammoniumsulfat und Methanol 3. Dennoch, all diese Modifikationen nur erlauben eine Detektion von etwa 10 ng Protein. Ein weit fameless Protokoll für kolloidale Coomassie-Färbung wurde von Kang et al. Im Jahr 2002, wo sie Neuhoff ist kolloidales CBB Färbeprotokoll geändert in Bezug auf die komplexierenden Substanzen. Anstelle von Ammoniumsulfat sie verwendet Aluminiumsulfat und Methanol wurde durch das weniger toxische Ethanol 4 ersetzt. Der Roman Aluminium-Färbung in Kang-Studie zeigte eine überlegene Empfindlichkeit, die so niedrig wie 1 ng / Band (Phosphorylase b) mit wenig Sensibilität Variation in Abhängigkeit von Proteinen entdeckt.
Hier zeigen wir Anwendung von Kang-Protokoll zur schnellen und sensitiven kolloidale Coomassie-Färbung von Proteinen in analytischen Zwecken. Wir zeigen die schnelle und einfache Protokoll mit zweidimensionalen Gels routinemäßig in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt.
Protokoll
Teil 1: Zweidimensionale (2-D)-Gelelektrophorese unter Verwendung cup-loading
- IPG-Streifen Rehydratation und isoelektrische Fokussierung (IEF)
- Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul Rehydrationslösung [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] mit Immobiline DryStrip Reswelling Tray für mindestens 10 Stunden.
- Lösen Sie ausgefallene Protein Probe in IEF-Probenpuffer [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] entspricht 60-100 ug Protein pro 100 ul .
- Nach Solubilisierung (mindestens ....
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Diskussion
Innovative oder nur ein weiterer Coomassie-Protokoll?
Im Moment gibt es mehrere Protokolle für Färbeverfahren mit Coomassie Brilliant Blue. Die meisten von ihnen aus kleineren oder größeren Modifikationen eines der am häufigsten verwendeten Protokolle, die von Neuhoff und seine Kollegen haben 2 Ergebnisse. Auch Kang-Protokoll auf Neuhoff-Formel basieren. Aber ist es wirklich eine Alternative Coomassie-Färbung für Proteomforschung? Wir werden Bild zwei Hauptthemen, Nachweisgrenze u.......
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Offenlegungen
Ich habe nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Dr. Nicola Wiethölter für die Vorbereitung und Färbung der 1-D Gelen.
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 bis ND und SM) gefördert und unterstützt durch ein Forschungsstipendium der Jürgen Manchot Stiftung zu ND.
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Materialien
| Name des Produkts | Firma | Katalog Nr. | Kommentare |
| Für IEF und SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip Gele | GE Healthcare | 17-6001-94 | Kann auch verwendet werden 2 Jahre nach Ablaufdatum werden. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Nicht mit organischen Lösungsmitteln. Konzipiert für 7-18 cm IPG-Streifen. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Beinhaltet ein Tablett, Elektrodenhalter, Anode und Kathode Elektroden, Ausrichter und Probengefäß bar und Probengefäße. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies bis 3500 Spannung V. |
| Multiphor II Elektrophorese-Einheit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Beweglichen Elektroden ermöglichen IEF in IPG-Streifen aller Länge (7-24 cm IPG-Streifen) |
| PerfectBlue Gel-System Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm Mini-Gel-Format. Gel Kammer enthält ein Kühlsystem. |
| Für kolloidale Coomassie G-250-Färbung: | |||
| Färbeschalen mit Deckel | VWR | 216-3412 | Passend für Mini-Gele. Steckbar auf Schüttler. |
| Aluminiumsulfat-18-Hydrat | Merck | 1.01102.5000 | Wir haben beste Erfahrungen mit Merck. Nur verfügbar in 5 kg-Paket. |
| Orthophosphorsäure | Prolabo | 20 624.295 | Verkauft in Glasflaschen. |
Referenzen
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
