Biz insan kortikal homojenatlarında açıklık, SDS-PAGE ile protein ayırma, antijen alımı ve Aβ peptid antikor immunoblotting hazırlanması için kullanılan bir tekniktir açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz sürekli olarak insanlarda Alzheimer patolojisi olan kortikal doku monomerik ve multimer Aβ algılar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında
Bu makalede
Özet
Özet
Β-amiloid anormal katlama ve polimerizasyon (Aβ) peptid Alzheimer hastalığının patogenezinde nörodejeneratif kaskad başlatmak için düşünülüyor
Protokol
Bölüm 1: açıklık doku homojenatlarında Hazırlık
- Yaklaşık 30 bile havaneli şart vuruş ile (yani ekle 400μl tampon - buz gibi soğuk tampon (artı 2x proteaz inhibitörü kokteyl [Santa Cruz] 0.1M fosfat tamponlu tuzlu [ve Mg + +-serbest Ca + +]) 4 kez hacmi Sabitlenmemiş kortikal doku homojenize Dounce 100 mg doku).
- 3.000 az 5 dakika Spin homojenatlarında g (4 ° C). Dikkatle -80 açıklık süpernatantlar ve bu özler mağaza alikotları kaldırmak ° C kullanana kadar.
- Üreticinin talimatlarına (ThermoFisher) göre, bir bicinchoninic asit (BCA) deneyi ile açıklık homojenatlarında total protein konsantrasyonu (mg / ml) belirleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Alzheimer hastalığı 1,4,5 patogenezinde Aβ agregasyonunun önemine rağmen, az sayıda çalışma açıklanan veya insan kortikal doku örnekleri 2 farklı Aβ multimerlerin sayısal dağılımı var. Yaygın olarak kullanılan immünohistokimyasal teknikler sabit kortikal doku, farklı multimer Aβ türlerin ayrımcılığa izin vermez. Sabitlenmemiş kortikal doku homojenatlarında, Aβ multimerleri ayrılmış ve biyokimyasal jel elektroforezi ve antikor tabanlı algılama yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Ancak, algılama.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Elaine Pranski ve mükemmel teknik yardım için Carolyn Suwyn ve Harry LeVine III, M. Paul Murphy ve Dişli Marla önemli konuşmalar için çok teşekkürler. Finansman RR-00165 PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, Woodruff Vakfı ve Emory Üniversitesi Araştırma Komitesi tarafından sağlanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Komple Proteaz İnhibitör Kokteyli Tabletleri | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 25ml tampon içinde 1 tablet |
| BCA Protein Analiz kiti | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell ve XCell II Blot Modül Kiti CE İşareti | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS Numune Tamponu (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Numune İndirgeyici Ajan (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Ön Boyalı Standart | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex %10-20 Tricine Jel 1.0 mm, 10 kuyucuklu | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitroselüloz membranlar, 0.2 μm gözenek boyutu | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Koşma Tamponu (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glisin Transfer Tamponu (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | İmmunboyamayı etkilemez |
| ATX Ponceau S Kırmızı boyama çözeltisi | Sigma-Aldrich | 09276 | İmmunboyamayı etkilemez |
| Kapak ısı ile mühürlenebilir plastik numune poşetleri | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| Aβ(1-16) için 6E10 fare monoklonal antikoru | Covance | SIG-39320 | WB için 1:1.000 ile 1:5.000 arasında seyreltin |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Fare IgG, HRP-Bağlı Tüm Aβ (koyundan) | GE Healthcare | NA931-1ML | 1:10.000 oranında seyreltin |
| SuperSignal West Pico Kemilüminesans Substrat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
Kaynaklar
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in n....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
